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HcRNAV109 virus like particle의 자가조립 및 숙주 특이적 살조능을 이용한 유해 미세조류 Heterocapsa circularisquama의 제어

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Author(s)
오혜경
Issued Date
2013
Keyword
HcRNAV109, VLP, HABs, harmful microalgae, TD49, host specific algicidal activity
Abstract
Harmful algal blooms (HABs) are characterized by rapid and massive accumulation of certain types of microscopic algae and HABs are linked to significant socio-economic losses and can give extensive damages to the aquatic ecosystem, drinking water sources and human health by depleting the dissolved oxygen and blocking the sunlight, or producing toxins. Recombinantly expressed and purified VLPs of Heterocapsa circiularisquama RNA virus (HcRNAV) can be used as a potent carrier for harmful algal bloom suppression. The HcRNAV strains were divided in two types; HcRNAV109 (CY-type) and HcRNAV34 (UA-type), based on their complementary strain-specific infectivity. Host specific attachment and cell destruction of HcRNAV109 VLPs against H. circularisquama strains were investigated under microscopy by encapsulating the particles with a novel algicidal substance, thiazolidinedione (TD49). The TD49 concentration was detected by HPLC analysis. The VLPs encapsidating TD49 specifically attached and destroyed the cells of H. circularisquama HY9423, which are the hosts of the HcRNAV109 strains, but not the cells of HU9433-P and HA92-1, which is known as a host of HcRNAV34 virus. These results indicate that the recombinant VLPs have considerably high host specificity and are compatible with a common viral property of host specific infection. Therefore we suggest the possibility that VLPs encapsidated algicidal agents can be used as an alternative and highly effective bio-control tool to prevent a harmful algal blooming in the sea.
Alternative Title
Self assembly of HcRNAV109 and controlling of harmful micoalgae, Heterocapsa circularisquama, by utilizing the host specific algicidal activity
Alternative Author(s)
Oh, Hye Gyung
Affiliation
조선대학교 대학원
Department
일반대학원 환경공학과
Advisor
김시욱
Awarded Date
2013-08
Table Of Contents
TABLE OF CONTENTS Ⅰ
LIST OF TABLES Ⅴ
LIST OF FIGURES Ⅵ
ABSTRACT Ⅸ

제 1 장 서 론 1
제 1 절 연구배경 1
제 2 절 연구목적 9
제 3 절 살조물질 TD49와 HcRANV VLP 13

제 2 장 실험 재료 및 방법 18
제 1 절 HcRNAV109 VLP 유전자 클로닝 18
1. HcRNAV109 VLP 유전자 합성 18
2. 플라스미드 및 제한효소 18
3. 사용 균주 18
4. Competent cell 제조 19
5. HcRNAV109 VLP 유전자 클로닝 19
가. 시약 및 기기 19
나. HcRNAV109 VLP 유전자 증폭 19
다. 유전자 단편 TA 클로닝 21
라. 플라스미드 정제 및 염기서열 확인 21
마. 제한효소 처리와 DNA의 분리 22
바. Ligation 및 형질전환 22
사. 형질전환된 균체로부터 플라스미드 확인 23

제 2 절 HcRNAV109 VLP 단백질 발현 23
1. 시약 및 기기 23
2. SDS-PAGE를 이용한 단백질 발현 확인 23
3. Western blot을 이용한 단백질 확인 24
4. 온도에 따른 단백질 발현 조건 탐색 25
5. IPTG 농도에 따른 단백질 발현 조건 탐색 25
6. E. coli strain에 따른 단백질 발현 조건 탐색 26
7. 최적화 조건에서의 단백질 발현 유도 및 cell free extract 제조 26

제 3 절 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 27
1. 시약 및 기기 27
2. Chitin affinity column을 이용한 재조합 pTXB1 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 27
3. Ni-NTA affinity column을 이용한 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 28
가. 재조합 pET30a(+) HcRNAV109-intein VLP 단백질 정제 28
나. 재조합 pHCE IA HcRNAV109 VLP 단백질 정제 28

제 4 절 HcRNAV109 VLPs의 자가조립 29
1. Dialysis를 통한 자가조립 유도 29
2. HcRNAV109 VLP의 구조 29

제 5 절 HcRNAV109 VLP의 숙주 특이성 30
1. 시약 및 기기 30
2. HcRNAV109 VLP 단백질의 형광물질 FITC 표지 30
3. 형광 현미경을 통한 FITC-labeled HcRNAV109 VLP의 숙주 특이성 관찰 30

제 6 절 TD49 탑재 및 숙주 특이적 살조능 31
1. 시약 및 기기 31
2. HPLC 분석에 의한 cell free extract에 용해되어있는 TD49 탑재 HcRNAV109 VLP 단백질 정량 분석 31
3. Cell free extract에 용해되어 있는 TD49 탑재 HcRNAV109 VLP 단백질의 숙주
특이적 살조 효과 32

제 7 절 대량배양 33
1. 시약 및 기기 33
2. 대량배양 33

제 3 장 결과 및 고찰 34
제 1 절 HcRNAV109 VLP 유전자 합성 34

제 2 절 재조합 HcRNAV109 VLP 유전자 클로닝 36

제 3 절 재조합 HcRNAV109 VLP 단백질 발현 39
1. 온도에 따른 최적의 단백질 발현 조건 확립 39
2. IPTG 농도에 따른 최적의 단백질 발현 조건 확립 42
3. E. coli strain에 따른 최적의 단백질 발현 조건 확립 45

제 4 절 각 affinity chromatography를 이용한 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 47
1. Chitin affinity column을 이용한 재조합 pTXB1 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 47
2. Ni-NTA affinity column을 이용한 HcRNAV109 VLP 단백질 정제 49
가. 재조합 pET30a(+) HcRNAV109-intein VLP 단백질 정제 49
나. 재조합 pHCE IA HcRNAV109 VLP 단백질 정제 52

제 5 절 자가 조립 유도를 통한 HcRNAV109 VLPs의 구조 관찰 54

제 6 절 HcRNAV109 VLP의 숙주 특이성 56
1. 형광물질 FITC가 표지된 HcRNAV109 VLP 단백질 확인 56
2. 형광 현미경을 통한 FITC-labeled HcRNAV109 VLP의 숙주 특이성 관찰 58

제 7 절 Cell free extract에 용해되어 있는 TD49 탑재 HcRNAV109 VLP 단백질의 숙주 특이적 살조 효과 61

제 8 절 대량배양 64

제 4 장 결 론 67

참고문헌 69
Degree
Master
Publisher
조선대학교 대학원
Citation
오혜경. (2013). HcRNAV109 virus like particle의 자가조립 및 숙주 특이적 살조능을 이용한 유해 미세조류 Heterocapsa circularisquama의 제어.
Type
Dissertation
URI
https://oak.chosun.ac.kr/handle/2020.oak/9862
http://chosun.dcollection.net/common/orgView/200000263908
Appears in Collections:
General Graduate School > 3. Theses(Master)
Authorize & License
  • AuthorizeOpen
  • Embargo2013-08-22
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