Berberine에 의한 구강암 KB 세포의 세포사멸 유도

Abstract

Ⅰ. 서론 최근 구강암의 발생률은 전체 악성 종양의 약 3~5 %에 해당되며, 구강암의 90 % 이상이 구강 편평 상피 암세포로 보고되고 있다. 이에 대한 치료 방법으로는 크게 수술요법, 방사선 요법 및 약물용법 등으로 구분될 수 있지만, 이런 화학요법에 사용되는 항암제는 많은 발전에도 불구하고, 항암제의 다양한 부작용을 해결하지 못하고 있다. 따라서 임상 항암제의 부작용을 최소화시키기 위하여 다양한 천연 약용 식물자원으로부터 암세포 사멸을 유도하고자 하는 항암 관련 천연물 신약 개발이 활발히 진행되고 있다. 본 연구는 천연 약용 식물인 황련의 주요 생리 활성 물질인 Berberine에 의한 구강 암세포 사멸을 확인하였으며, 이에 대한 분자 생물학적 세포사멸 기전을 분석하였다.

Ⅱ. 연구목적 황련 (Costidis Rhizoma, Coptis japonica Makino)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 다년생 초목으로서 특이적 세포 사멸 유도 물질인 Berberine에 의한 구강암 KB 세포 사멸의 분자 생물학적 기전 분석 등을 연구하였다. 추후 이를 통한 부작용을 최소화하고 천연물 신약 개발에 많은 도움이 되리라 생각한다.

Ⅲ. 연구방법 본 실험에서는 구강암 KB 세포(American Tissue Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, UAS), Human Normal Oral Keratinocyte (HNOK, Science Cell Research Laboratories, ATCC, Manassas, VA, USA)를 사용하였으며, 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 계대 배양하였다. Berberine에 의한 세포성장 억제효과를 관찰하기 위하여 MTT (3-[4,5]-dimethylithiazol-2-ly]-2,5-diphenyltetra zolium bromide) assay를 이용하였다. 96 well-plate에 다양한 Berberine의 농도 (0, 0.01, 0.1, 1 μg/mL)로 처리하고 ELISA microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., Wilnooski, VT)를 사용하여 570 nm에서 시행하였다. 또한, Berberine에 의한 세포 사멸 기전을 확인하기 위해 western blot을 시행하였고, DNA 분절 현상을 분석하였다. Berberine에 의한 구강암 KB 세포의 형태적 변화 및 apoptotic body의 형성을 분석하기 위하여 구강암 KB 세포에 0, 0.01, 0.1, 및 1 μg/mL 농도의 berberine을 처리한 뒤 H&E staining와 4‘-6-diamidino-2-phenylindol-2HCl (DAPI, Sigma Co., St. Louis, MO, USA, D-8417)을 사용한 DAPI staining 을 수행하였다. 그리고 구강암 KB 세포에 세포사멸 유도의 분자유전학기전을 규명하기 위해 Berberine (0, 0.1, 1 μg/mL)을 처리하고 세포침투성 형광 기질인 PhiPhiLux-G1D2 (OncoImmunin, Inc. Gaithersburg, MD, USA), Annexin V-FITC, Nicon사 형광현미경 (ECLIPSE, Nicon) 및 표준 FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 이용하여 내인성과 외인성 세포사멸 경로의 하방에서 신호 전달의 필수적인 역할을 하는 caspase-3,-8,-9의 발현정도를 확인하였다.

Ⅳ. 실험결과 구강암 KB 세포에 적용하여 항암작용을 밝히고자 시행한 본 연구에서는 MTT assay를 수행하였고 그 기전연구를 위해 DNA fragmentation과 western blot 등을 수행하여 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. HNOK에서는 Berberine을 처리하였을 때, 모든 농도에서 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 반면, 구강암 KB 세포에서는 0.01, 0.1, 1 μg/mL의 Berberine을 처리하였을 때각각 73 %, 67 %, 50 %의 세포 억제능을 확인하였다. 특히, Berberine이 1 μg/mL의 농도일 때, 대조군에 비하여 생존 세포수율이 50 %로 나타남에 따라 Berberine이 IC50임을 알 수 있었다. 2. Berberine에 의한 구강암 KB 세포의 apoptosis 유도를 알아보기 위해 Berberine 5 μg/mL을 24 시간동안 처리한 후 DNA fragmentation을 확인한 결과 DNA 분절을 확인하였다. 3. 구강암 KB 세포에서 Berberine이 apoptosis에 의한 세포사멸을 유도하는지 조사하기 위해 apoptosis를 활성화 시키는 단백질인 caspase-3, -8, -9이 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였으며, Bad의 발현이 증가하면서 BCl-2 단백질의 발현이 Berberine의 처리 농도 의존적으로 확연히 감소되었고, Bax 단백질의 발현은 Berberine의 처리 농도 의존적으로 증가됨을 알 수 있었다.

Ⅴ. 결론 결론적으로, 이 연구에서는 기존의 알려진 항암제 보다 안전하고 뛰어난 항암 물질을 개발하고자 Berberine의 효능을 구강암 KB 세포에 적용하여 연구하였다. 그 결과 구강암 KB 세포에 Berberine 1 μg/mL농도로 처리하게 되면 세포의 증식을 빠른 시간 내에 억제시킬 수 있을 뿐 아니라 apoptosis라는 세포사멸을 유도해 효과적인 항암 후보물질이 될 수 있으며, 구강암에 특이적인 항암제로서 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.