Isolation and Characterization of New Insulin-mimetic Compounds from Medicinal Plants

Abstract

2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 고지혈증과 같은 비만 관련된 질병은 전세계에 걸쳐 주요한 질환 위험으로 나타나고 있다. 당뇨병과 인슐린 내성증후군은 전세계 사망원인 중 수위를 나타내고 이다. 이러한 질환들은 순환계 합병증, 신장기능 이상, 망막손실 및 관절부위 이상과 같은 합병증의 위험을 증대시킨다. 당뇨병 중 2형 당뇨병이 가장 일반적이며 인간의 사망위험의 증가 및 위험도와 관련이 있다. 2형 당뇨병은 췌장에서의 인슐린 분비 저하 및 작용지점에서의 기능이상으로, 혈액에서의 당 농도 조절작용의 실패에 기인한 혈중 당 농도가 증가하는 특징을 갖는다. 탄수화물 식사 후 췌장으로부터 혈액으로 분비되는 호르몬인 인슐린은 당을 근육, 지방세포 및 심장으로 저장을 증가시켜 혈중의 당 농도를 조절한다. 그러나, 당뇨병 환자에게 있어서는 췌장으로부터 충분한 인슐린을 생산하지 못하거나 생산된 인슐린이 작용하지 못하는 특징을 갖는다. 즉, 혈액속의 당 농도를 조절하지 못하는 인슐린 내성이 2형 당뇨병 환자에게 있어서 가장 중요한 원인이다. 그리하여 인슐린 신호전달 과정에 작용하여 인슐린 작용을 개선시키는 천연물질 및 합성 저분자 물질의 개발이 시도되고 있다. 그러나, 현재까지 임상시도 되고 있는 약물은 심장에서의 부작용과 낮은 활성으로 인하여 인슐린과 같은 효율적인 약물의 개발은 성공하지 못하고 있다. 최근의 많은 증거는 heterotrimeric serine/threonine kinase의 일종인 AMPK 효소가 인슐린 작용을 증가시키는 것으로 알려지고 있다. AMPK 효소는 세포 및 신체 전반에 걸쳐 에너지 상태를 조절하는 주요한 작용을 한다. 활성화된 AMPK 효소는 ATP를 생산하는 대사통로를 활성화하고 ATP를 소모하는 대사계를 불활성화 시키는 것으로 알려져 있다. AMPK 효소는 많은 관련 하위 조절자들을 통제하여, 즉 근육에서의 glucose uptake를 촉진하고 간에서는 글루코스 생산을 억제하며, 말초 지방조직에서는 극소적인 지방 축적을 저해하여 신체 전체에 걸쳐 인슐린 민감도를 개선하는 것으로 알려지고 있다. 그러므로 AMPK 효소는 현재 비만과 당뇨를 치료하는 좋은 약물 목표로 각광받고 잇다. 약용식물로부터 항 당뇨물질을 개발하기 위한 계속적인 연구목표로 두 종류의 Morinda 속 식물인 (M. longissima and M. citrifolia)가 분화된 3T3-L1 지방세포에서 강하게 glucose uptake를 증가시키는 것으로 관찰하였다. 이러한 약용식물로부터 화학적 구성성분을 크로마토그래픽적인 방법 (silica gel, RP-C18, MPLC와 preparative HPLC system)을 사용하여 신규 화합물 9개 (10, 42, 47, 49, 51-53, 57와 59)를 포함하여 59개의 물질을 분리하였다. 분리한 화합물 각각의 화학구조는 분광학적인 방법 (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY와 MS) 및 이화학적인 방법 (IR, UV, CD, and [α]D)으로 결정되었으며 기지물질은 또한 기존의 문헌값들과 비교를 통하여 확인하였다. 얻어진 물질들을 화합물의 골격에 따라 나누어 보면 21개의 안트라퀴논 (anthraquinones, 1-21), 2개의 코마린 (coumarinoids, 23 과 26), 12개의 페닐프로파노이드와 카페인산 (phenylpropanoid and caffeic acid derivatives, 22-35), 2개의 프라보노이드 (flavonol and flavonol glucoside, 40 와 41), 3개의 이리도이드 (iridoids, 36-38), 1개의 트리터페노이드 (triterpenoid, 39) 와 18개의 리그난 및 네오리그난 (lignans and neolignans, 42-59)으로 구별될 수 있다. 분리된 모든 화합물 (1-59)의 분화된 3T3-L1 지방세포에서 glucose uptake 작용의 효과를 측정하였다. 최종농도 10 M의 농도에서 몇몇 화합물 들은 강한 2-NBDG 시약을 이용한 실험에서 glucose uptake를 증가시키는 것으로 확인되었다. 안트라퀴논 화합물 (1-21) 중에서는 화합물 2, 8, 그리고 10이 특히 강한 glucose uptake를 증가시켰으며 몇몇 다른 화합물은 보통의 증가효과를 보였다. 그리하여 우리는 화합물 2, 8 및 10번 화합물을 이용하여 세포내에서 형광물질의 존재를 측정하는 방법을 사용하여 2-NBDG의 화합물에 의한 효과를 보다 정밀하게 분석하였다. 노니로부터 분리된 화합물 (22-59)을 이용하여 2-NBDG의 glucose uptake 효능을 측정한 결과 7,9':7',9-diepoxylignan과 3',7-epoxy-8,4'-oxyneolignan이 가장 강한 활성을 보였으며, 주 화합물 가운데 화합물 39 (ursolic acid, at 20 µM)에서 양성 대조군인 rosiglitazone (400 µM)보다 강한 저해활성을 갖음을 또한 확인하였다. 계속적인 연구로 화합물들의 AMPK 효소 활성화 작용을 검토 하였다. 분화된 근육세포에서 AMPK (Thr172)에서의 인산화 증가활성을 화합물 최종농도 10 M과 양성대조군인 AICAR (1 mM)로하여 측정한 결과 화합물 8이 강한 활성화 작용이 있으며, 화합물 10과 20은 중간 정도의 활성화 작용이 있음을 확인하였다. 분리된 리그난 계열의 화합물 중 9,7'α-epoxylignano-7α,9'-lactone (48)과 triterpenoid (39)과 가장 강한 활성을 보여 주었다. 이러한 결과는 분리돤 화합물 (2, 8, 10, 20, 39, 42, 44, 45와 48)의 높은 glucose uptake 활성이 AMPK 효소의 활성증가와 관련될 수 있음을 나타낸다. 결론적으로 우리의 결과는 Morinda 속 식물인 (M. longissima와 M. citrifolia) 로부터 분리된 화합물 중 안트라퀴논 (anthraquinones)과 ursolic acid, 7,9':7',9-diepoxylignans들 특히 9,7'α-epoxylignano-7α,9'-lactone이 2-NBDG uptake를 증가시키는 과정에서 중요한 화합물임을 밝혔다. 앞으로 이러한 화합물을 이용하여 추가적인 기전연구 및 효능평가가 필요한 것으로 사료된다.|Obesity associated diseases like type 2 diabetes, the metabolic syndrome, hypertension, and atherogenic dyslipidemia represent major health risks around the world. Diabetes mellitus (DM) and/or insulin resistance (IR) are ranked in the top ten causes of mortality worldwide. Both disorders often lead to disability through vascular complications, renal failure, blindness, and limb amputation. Of which, type 2 diabetes mellitus (T2DM) is the most common, prevalent and fastest growing form of the disease and the principal cause of morbidity and mortality in human. It is often complicated by obesity and characterized by high levels of glucose in the bloodstream, resulting from impairment at insulin release and its action. Insulin, a natural hormone which is secreted by the pancreatic β-cells into the bloodstream after the consumption of carbohydrate rich meals, causes skeletal muscle, adipose, and heart, to increase their uptake of glucose for the production of ATP. In diabetes patients, however, either the pancreas cannot produces enough insulin for regulating blood glucose levels (Type 1), or the body cannot use insulin produced effectively (Type 2). Insulin resistance, resulting in loss of proper glucose homeostasis, is considered as the most important factor of type-2 diabetes and is generally due to defects in insulin-mediated signal transduction. Thus, a number of small molecular (including synthetic and natural products) materials affected in insulin signaling pathway are being investigated for improving insulin sensitivity and/or mimicking the action of insulin. However, clinical tests have shown that none of these compounds can replace insulin in the treatment of diabetes without causing adverse effects such as cardiac arrest. Recent some evidences have emerged that AMPK, a heterotrimeric serine/threonine kinase, could be responsible for increasing insulin sensitivity and indirectly inhibit preadipocyte differentiation by improving insulin action. AMPK is well established as a key sensor and regulator of intracellular and whole-body energy metabolism. Activated AMPK re-establishes the proper energy balance in the cell by switching off the ATP-consuming anabolic pathways and switching on the ATP-generating catabolic pathways. Many downstream targets of AMPK have demonstrated the role of AMPK in glucose and lipid metabolism, such as stimulating glucose uptake in the muscle, suppressing hepatic glucose production in the liver, and reducing ectopic lipid accumulation for improving insulin sensitivity. Therefore, AMPK activators are considered as promising drugs for diabetes and obesity. As part of our ongoing investigation for discovering new anti-diabetes agents from medicinal plants, we found that the total extracts of two Morinda species (M. longissima and M. citrifolia) showed in vitro glucose uptake effects on 3T3-L1 adipocytes. Thus, phytochemical investigation of these medicinal plants using chromatographic methods (silica gel, RP-C18, MPLC, and preparative HPLC system) led to the isolation of 59 natural products, comprising of 9 new compounds (10, 42, 47, 49, 51-53, 57, and 59) as active constituents. Their chemical structures were elucidated on the basis of spectroscopic (including 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, and MS) data interpretation and physicochemical (IR, UV, CD, and [α]D) data analyses, as well as comparison with those published in literatures. According to the structural skeleton, their structures were characterized to be 21 anthraquinones (1-21), 2 coumarinoids (23 and 26), 12 phenylpropanoid and caffeic acid derivatives (22-35), 2 flavonol and flavonol glucoside (40 and 41), 3 iridoids (36-38), one triterpenoid (39), and 18 lignans and neolignans (42-59). After structural elucidation, the isolates (1-59) were investigated for their stimulatory effects on glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes. At the concentration of 10 M, some of isolated compounds showed significant enhancing activity on glucose uptake with 2-NBDG reagent. Among the anthraquinones (1-21), compounds 2, 8, and 10 were found to possess stronger stimulatory effect at the combination of isolated compounds and insulin than insulin, a positive control. The others showed increasing effect to a level comparable with insulin. Thus, we further confirmed the transportation efficacy of 2-NBDG into the cells of compounds 2, 8, 10, and 20 by measuring fluorescent signals induced after drug treatment. Comparing to control group, compounds 2, 8, and 10 showed higher levels of fluorescent signals from the adipocytes representing the inducement of 2-NBDG uptake into the cells. Among the compounds isolated from Noni (22-59), we found that the 7,9':7',9-diepoxylignan and 3',7-epoxy-8,4'-oxyneolignan possessed strongest activity, and the most major compound 39 (ursolic acid, at 20 µM) showed stronger activity than rosiglitazone, the positive control used at 400 µM. In progress, we investigated whether these 2-NBDG uptake inducers activate AMPK or not. In differentiated C2C12 cells, we observed increased phosphorylation of AMPK (Thr172) by our compounds at the concentration of 10 M to a level comparable with AICAR, a positive control used at 1 mM. Anthraquinones 8 showed strongest activation, followed by compounds 10 and 20. Among the lignan type, 9,7'α-epoxylignano-7α,9'-lactone (48) and triterpenoid (39) showed strongest activation. These observation suggest that the AMPK signaling pathway is likely responsible for the improvement of glucose uptake by these compounds (2, 8, 10, 20, 39, 42, 44, 45, and 48). Taken together, our results indicated that anthraquinones, ursolic acid, and 7,9':7',9-diepoxylignans, especially the 9,7'α-epoxylignano-7α,9'-lactone, may be important for 2-NBDG uptake activity in vitro. Additionally, 2-NBDG uptake effects by members of anthraquinones and neolignans have not been previously reported. Further confirmation of the anti-diabetes effects of these natural products and evaluation of their potential in vivo efficacy in a diabetic model are necessary.