패혈증 비브리오균에서 햄수용체 단백 유전자의 조절기전

Abstract

패혈증 비브리오균 햄수용체 단백 유전자의 조절기전

패혈증 비브리오균은 감수성이 있는 환자, 특히 혈청 철 농도가 높아진 환자에서 매우 빠르게 진행하며 치명적인 감염증을 초래한다. 높아진 철 농도를 선호하는 패혈증 비브리오균은 외막에 존재하는 햄수용체 단백인 HupA를 통해 헤모글로빈과 같은 햄단백으로부터 직접 철을 획득할 수 있다. 햄수용체 단백을 암호화하는 hupA유전자의 발현은 철 농도에 반응하여 유전자발현을 억제하는 철흡수조절인자(Ferric uptake regulator: Fur)에 의해 음성적으로 조절되며, 최근에는 포도당 고갈에 반응하여 유전자발현을 활성화시키는 cyclic AMP 수용체 단백(cAMP-receptor protein: Crp)에 의해 양성적으로 조절된다고 알려졌다. 본 연구에서는 일차적으로 패혈증 비브리오균이 헤모글로빈을 철 공급원으로 직접 이용하는데 있어 HupA의 역할을 검증하고, 패혈증 비브리오균 임상 그리고 환경 분리주에서 HupA의 분포를 조사하며, hupA 유전자의 발현 조절을 위해 Fur와 Crp가 어떻게 협조적으로 작용하는가를 규명하고자 하였다. 유전자결손 방법에 의해 hupA 유전자의 돌연변이를 유발하였을 경우 패혈증 비브리오균의 헤모글로빈 이용능력은 소실되었고 이러한 결함은 플라스미드를 통해 온전한 hupA유전자를 보충하였을 때 다시 회복되었다. 패혈증 비브리오균 임상 분리주 10주 중 2주, 그리고 환경 분리주 10주 중 1주만이 hupA 유전자를 가지고 있지 않았고 HupA단백을 발현하지도 않았다. 유전자결손 방법에 의해 crp 유전자에 돌연변이를 유발하였을 때 hupA 유전자의 발현은 현저히 억제되었고 이러한 결함은 플라스미드를 통해 온전한 crp 유전자를 보충하였을 때 다시 회복되었다. 더불어, cyclic AMP합성에 필요한 효소인 adenylate cyclase를 암호화하는 cyaA에 유전자결손 돌연변이를 유발하였을 경우에도 hupA 유전자의 발현은 현저히 억제되었고, 이러한 결함은 플라스미드를 통해 온전한 cyaA유전자를 보충하였을 때와 외부에서 cyclic AMP을 첨가하여 주었을 때 다시 회복되었다. 유전자 결손 방법에 의해 fur 유전자에 돌연변이를 유발하였을 때 hupA 유전자의 발현이 철에 의해 억제되지 않았고, 이러한 변화는 플라스미드를 통해 온전한 fur유전자를 보충하였을 때 다시 회복되었다. 철을 더욱 결핍시킨 환경에서 hupA 유전자는 Crp가 없을 때에도 발현되었으나 Crp가 없을 때 보다는 Crp가 존재할 때 더 높은 수준으로 발현되었다. 포도당은 Fur가 존재할 때에는 hupA유전자의 발현을 용량의존적으로 그리고 완전하게 억제할 수 있었으나 Fur가 존재하지 않을 때에는 용량의존적으로 억제하지 못하였다. 이러한 결과를 종합하면, (1) HupA는 철공급원인 햄단백을 직접 이용하는데 관여하며, (2) HupA는 패혈증 비브리오균 임상분리주뿐 아니라 환경분리주에도 널리 분포되어 있으며, (3) 철이 결핍된 환경에서 포도당 고갈은 hupA유전자의 발현을 위해 상승적으로 작용하고, (4) Fur는 철 농도에 반응하여 hupA 유전자의 발현을 억제하기 위해 필수적이며, (5) Crp는 필수적으로 필요하지는 않을지라도 포도당 농도에 반응하여 hupA유전자의 발현을 최적화하는 데 필요한 전사활성인자임을 알 수 있다.|Regulatory Mechanism of the hupA Gene Encoding Heme Receptor Protein in Vibrio vulnificus

Vibrio vulnificus causes rapid progressing fulminant infections in susceptible individuals, especially those with elevated serum iron levels. This ferrophilic bacterium can directly acquire iron from heme-containing proteins, such as hemoglobin, via its outer membrane heme receptor HupA. The expression of hupA has been known to be under the negative control of Fur (Ferric uptake regulator) which functions as a transcription repressor in response to iron sufficiency, and recently, to be under the positive control of Crp (cAMP-receptor protein) which functions as an transcription activator in response to glucose deprivation. The purpose of this study was to confirm the role of HupA in the direct utilization of hemoglobin, to examine the distribution of HupA in V. vulnificus clinical and environmental isolates, and finally, to detail the coordinate roles played by Fur and Crp in the regulation of hupA expression. An in frame deletion mutation in hupA abolished the ability of V. vulnificus to utilize hemoglobin as an iron source under iron-deficient (ID) conditions and this defect was rescued by in trans complementing wild-type hupA. Only two of ten clinical isolates and one of ten environmental isolates did not possess hupA DNA or expressed HupA protein under ID conditions. An in frame deletion mutation in crp repressed hupA expression under ID conditions, and this defect was recovered by in trans complementing wild-type crp. In addition, an in frame deletion mutation in cyaA encoding adenylate cyclase required for cAMP synthesis repressed hupA expression under ID conditions and this defect was recovered by in trans complementing wild-type cyaA. An in frame deletion mutation in fur de-repressed hupA expression under iron-sufficient (IS) conditions and this change is recovered by in trans complementing wild-type fur. Under severely ID conditions, hupA expression was induced at higher levels in the presence of Crp than in the absence of Crp. Glucose dose-dependently and completely repressed hupA expression only in the presence of Fur, but not in the absence of Fur. These results indicate that (i) HupA is involved in the utilization of heme iron, (ii) HupA is widespread among V. vulnificus strains, (iii) glucose deprivation under iron limitation synergistically activates hupA expression; (iv) Fur is essentially required to prevent hupA over-expression in response to iron availability; and (v) Crp is an activator required for optimal hupA expression in response to glucose availability.