Antimicrobial effects and mechanism of action of dendrimer peptides against human pathogens

Abstract

초 록

항생제 기능성 방사형 구조 펩타이드의 개발 및 항생 활성의 작용 기작 연구

나 형 종 지도교수 : 박윤경 생명공학과 조선대학교 대학원

현재 다양한 항생제가 개발이 되어 많은 질병에 사용되었다. 하지만 항생제의 과다 및 남용으로 인하여 저항성 균이 출현하였고, 새로운 항생제의 대체물질이 요구 되었다. 그 중에 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)는 매우 빠른 작용과 세포막을 직접 공격함으로써 내성을 가지기 어렵다는 것으로 알려져 있다. 하지만 항균 펩타이드는 인체내부에 존재 하는 효소들에 의한 안정성이 약한 경우가 많아 펩타이드 결합이 끝어지거나 박테리아에 대한 활성을 잃어버려서 항균 펩타이드가 인체내부에 침입을한 균에 작용을 못 하게 되다. 또한 항균 펩타이드가 박테리아뿐만 아니라 적혈구나 동물세포에 대해서 독성을 가진 경우가 있다. 그 대체방법으로 펩타이드의 구조를 방사형태(Dendrimer)로 만들면 박테리아에 대한 활성이 저하되지 않고, 적혈구와 동물세포에 대한 독성을 줄일 수 있는 것으로 보고됐다. 이에 박테리아에 대한 활성이 좋으나 적혈구와 동물세포에 독성이 있는 펩타이드를 디자인하여 그 구조를 방사형(dendrimer)형태로 디자인 하여 박테리아에 대한 활성을 유지하며 적혈구 및 동물세포에 대하여 독성을 줄이고자 한다. 이 논문은 KLWK를 기본으로 펩타이드 디자인하여 반복된 구조를 가진 펩타이드를 설계하였다. 즉, 3종류의 일반적인 형태 Linear 펩타이드(LIN1-1: (KLWK)2, LIN1-2: (KLWK)4, LIN1-3: (KLWK)8)와 3종류의 방사형인 Dendrimer(DEN1-1: (KLWK)2[K], DEN1-2: (KLWK)4[K2K], DEN1-3: (KLWK)8[K2K]2K)로 디자인을 하였다. 합성된 linear 펩타이드와 dendrimer 펩타이드를 이용하여 그람 음성 균과 양성 균에 대한 항균 활성과 yeast에 대한 항진균 활성을 측정을 하여 linear 펩타이드와 dendrimer 펩타이드가 다양한 균주에 대한 활성이 있음을 확인을 하였고, 항생제에 저항성을 가진 S. aureus와 P. aeruginosa에 대한 활성을 측정 한 결과 항생제 저항성을 가진 균에서도 항생 활성을 가짐을 확인 하였다. Hemolysis와 cytotoxicy test를 하여 적혈구와 동물세포에 대한 독성이 linear 펩타이드와 비교해서 dendrimer 펩타이드가 독성이 적은 것을 볼 수 있고. 또한 P. aeruginosa의 biofilm 형성억제와 제거반응을 확인한 결과 형성에는 좋은 활성을 보였고, biofilm 제거에는 일정농도 이상에서 항생활성 작용한다는 것을 확인할 수 있었다. 이들 펩타이드의 작용 기작을 확인하기 위하여 time killing실험과 SYTOX green실험을 수행하였다. 그 결과 세포막에 작용 한다는 것을 유추할 수 있었으며, 주사전자현미경(SEM)을 통하여서 세포막을 작용한다는 것을 다시 한 번 확인 할 수 있었다. 결과적으로 dendrimer 펩타이드와 linear 펩타이드의 in vitro 비교 실험을 통해서 dendrimer 펩타이드가 세균에 대해서 강한 항생 활성을 유지하면서 인간 적혈구와 동물세포에대해 세포독성이 줄어든다는 것을 확인 하였다. 기존에 알려진 항균펩타이드 설계 방법 중에서 아미노산 서열을 치환하지 않고 세포독성을 줄일 수 있는 다른 하나의 방법이라 할 수 있다.