Vibrio metschnikovii 균주로부터 분비되는 새로운 알칼리성 세린계열 단백질분해효소의 정제 및 특성 연구

Abstract

해양성 박테리아인 Vibrio metschnikovii (V. metschnikovii )는 상처를 통해 침투하여 폐렴, 궤양 및 설사 등의 심각한 증상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는, V. metschnikovii ATCC700040 균주의 배양상층액으로부터 새로운 알칼리성 세린계열 단백질분해효소를 분리․정제 하였으며, 그 생화학적 특성 및 인간혈액응고단백질들에 미치는 영향을 연구하였다. 이 균주를 3% NaCl이 포함된 pH 7.5의 LB배지에서 배양하였을때, 최대의 단백질분해활성이 나타는 것을 확인하였다. 새로운 단백질분해효소를 분리하기 위하여, 모든 세포외단백질들을 70%의 황산암모늄 [(NH4)2SO4] 처리과정을 통해 침전시켰고, 이 단백질들을 Hiprep 16/10 Q FF, Source 15 Q 4.6/100 PE 및 Superdex 75 10/300 GL 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 사용하여 단백질분해효소를 분리하였다. 순리 분리한 이 효소는 Vm-AP (V. metschnikovii alkaline protease)라 명명하였다. Vm-AP는 SDS-PAGE의 열처리 과정에서 분해되었는데, 이러한 분해는 CuCl2, ZnCl2 및 NiCl2를 첨가함으로써 억제할 수 있었다. 이 효소는 단일 폴리펩타이드로 구성되어 있었으며, CuCl2가 존재하는 환원상태 하에서 50 kDa, 비환원상태 하에서 40 kDa이 분자량을 지님을 12% SDS- 폴리아크릴아미드 겔 상에서 확인하였다. 발색성기질을 이용한 실험에서, 트롬빈의 대표적인 기질로 알려진 Boc-VPR-pNA가 이 효소에 대해 가장 특이적인 것으로 확인하였다. 이 기질을 이용하여 Vm-AP의 KM, kcat 및 kcat/KM 값이 각각 0.91 mM, 0.8 s-1 와 0.88 mM-1s-1임을 확인하였다. Vm-AP의 효소활성에 대한 최적온도와 pH는 각각 37℃ 와 pH 9.5이었으며, pH 8.0~12.0인 알칼리 환경에서 상대적으로 강한 활성을 나타내는 것으로 보아 이 효소가 알칼리성 단백질분해효소라는 사실을 알 수 있었다. 세린단백질 분해효소의 억제제로 알려진 PMSF와 aprotinin를 첨가하였을 때, 약 81.1%의 Vm-AP 활성이 감소하였는데, 이러한 결과는 본 효소가 세린계열 단백질 분해효소라는 사실을 나타낸다. Vm-AP 효소는 플라스미노겐, 플라스민, 프로트롬빈 및 트롬빈과 같은 다수의 혈액응고단백질들을 절단하였으며, 또한 강력한 피브리노겐 절단활성을 보였다. 이 효소는 γ-사슬을 포함한 피브리노겐의 모든 폴리펩타이드 사슬을 분해하였고, 피브린 중합체 및 교차-연결된 피브린까지도 분해하는 것을 확인하였다. 이러한 모든 결과를 종합하여, 병원성 균주인 V. metschnikovii는 감염 시 Vm-AP를 분비하여 혈액응고시스템을 교란시킬 가능성을 시사하는 것이다.|The marine bacterium Vibrio metschnikovii (V. metschnikovii ) evokes serious symptoms, including pneumonia, leg ulcer, and diarrheal disease when it infects a wound. In this study, a novel extracellular alkaline serine protease was purified from culture supernatant of V. metschnikovii ATCC700040 and its biochemical features and effects on human blood coagulation-associated proteins were investigated. The maximal protease activity could be obtained when the bacterium was cultured in LB medium (pH 7.5) containing 3% NaCl at 30℃. To purify a proteolytic enzyme, total extracellular proteins from V. metschnikovii cells cultivated in LB medium containing 3% NaCl at 30℃ were precipitated by the addition of 70% ammonium sulfate [(NH4)2SO4]. The precipitated proteins were applied onto Hiprep 16/10 Q FF, Source 15 Q 4.6/100 PE, and Superdex 75 10/300 GL columns in order, and Vm-AP (stands for V. metschnikovii alkaline protease) could be purified at the final purification step with near homogeneity. The purified Vm-AP seemed to be degraded by the heating step for SDS-PAGE. However, the degradation could be inhibited by the addition of divalent cations such as CuCl2, ZnCl2, and NiCl2. Vm-AP was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be approximately 50 kDa under reducing condition in the presence of CuCl2 and about 40 kDa under non-reducing condition on 12% SDS-polyacrylamide gel. Among synthetic chromogenic substrates tested, Boc-VPR-pNA that is known as a typical chromogenic substrate for thrombin was the most favorable one for the enzyme. When the chromogenic substrate was used as a substrate, kinetic values for Vm-AP were as follows: KM = 0.91 mM, kcat = 0.8 s-1, and kcat/KM = 0.88 mM-1s-1. The optimal temperature and the pH for Vm-AP enzyme activity were 37℃ and pH 9.5, respectively. In addition, the maximal protease activity could be found under alkalic condition ranging from pH 8.0 to 12.0, suggesting that Vm-AP can be included in alkaline protease family. Approximately 81.1% of Vm-AP activity could be inhibited by the addition of serine protease inhibitors such as PMSF and aprotinin. These results suggest that Vm-AP is a member of serine protease. Vm-AP could cleave various blood coagulation-associated proteins, including plasminogen, plasmin, prothrombin, and thrombin. In addition, the enzyme showed a powerful fibrin(ogen)olytic activity, as it could cleave all kinds of chains of fibrinogen, even with γ-chain of fibrinogen, fibrin polymer, and cross-linked fibrin. Taken together, the results obtained by the present study suggest that the pathogenic bacterium V. metschnikovii might disturb the blood coagulation system by secreting an alkaline Vm-AP protease during the course of bacterial infection.