Translucent Colony-type Vibrio vulnificus 균주에서 Group 1 CPS Operon의 유전자 구성과 잠재적인 독력인자의 발현

Abstract

Vibrio vulnificus 패혈증은 기회감염을 유발하며 높은 치사율을 가진 병원균이다. 협막(capsular polysaccharide: CPS)을 포함하여 철획득능, 세포독성, 운동성 그리고 부착이나 유착과 관련된 단백질 발현 등이 이 병원균의 독력인자로써 발병에 중요한 역할을 한다. 협막은 가장 중요한 독력인자 중 하나로 알려져 있다. Translucent colony-type (T-type) 균주는 협막 형성이 감소하였거나 없는 균으로 다른 독력인자들의 변화를 동반할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 15가지의 T-type 균주를 선택하여 group 1 CPS operon의 구성유전자들의 조성을 조사하였다. 또한 협막 이외의 다른 독력인자의 발현을 조사하였고 이들 독력인자들 사이에 상호연관성을 분석하였다. Southern blot 분석에서 T-type 균주들은 group 1 CPS operon을 가지고 있지만 관련된 몇 몇의 유전자들이 결손되어 있었으며 이와 같이 결손된 유전자의 종류에 있어서는 개체 간에 차이를 보였다. PCR과 Western blot 분석에서 대부분의 T-type 균주는 철획득능과 관련된 몇 몇의 유전자와 이들 유전자 산물들이 발현하였으나 몇 몇 균주들은 이러한 유전자와 유전자 산물에 결손이 있었다. Urea-gel electrophoresis에서 T-type 균주들은 transferrin-bound iron을 이용할 수 있었으며 그 정도는 개체 간에 차이를 보였다. 반고체배지에서 T-type 균주들은 유주 운동성을 보였으며 그 정도는 개체 간에 차이를 보였다. T-type 균주들은 개체 간의 차이가 있으나 HeLa P3 (S) cells에 효율적으로 부착하였다. LDH assay에서 그들은 HeLa P3 (S)에 세포독성을 나타내었고 그 정도는 개체 간에 차이를 보였다. Multi-well plate에서 T-type 균주들은 생물막을 형성하였고 그 정도는 개체 차이를 보였다. 이들 독력인자들 사이의 상호관계를 통계적 분석을 하였을 때 유주운동성은 세포 부착능, 세포독성과 양성의 상호관계를 나타내었고 이러한 인자들은 생물막 형성과 음성의 상호관계를 나타내었다. 한 균주를 제외한 모든 T-type 균주들의 마우스에 대한 치사율이 협막을 가진 M06-24/O 균주의 마우스 치사율에 비해 현저히 감소되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 협막의 존재유무가 마우스 치사율을 결정하는 가장 중요한 독력인자인 것으로 보이며 T-type 균주들은 다른 독력인자들의 변화를 동반하지 않으며 유주운동성은 세포부착과 세포독성에서 중요한 역할을 하지만 생물막 형성은 세포부착과 세포독성을 저해하는 것으로 여겨진다. 예외적으로 협막 외에 마우스 치사율을 결정할 가능성이 있는 아직 알려지지 않은 다른 독력인자가 있을 수 있음을 알 수 있었다.|Vibrio vulnificusis an opportunistic but highly lethal human pathogen. A wide array of virulence factors, including capsular polysaccharide (CPS) expression, iron acquisition, cytotoxicity, motility, and expression of proteins involved in attachment or adhesion, play significant roles in the pathogenesis of the organism. CPS is one of the few known virulence factors that are absolutely required for pathogenicity. It has been known that translucent colony-type (T-type) strains with reduced or no capsule can accompany the changes of the other virulence traits. In this study, 15 T-type strains were selected to inspect group 1 CPS operon and virulence factors. On PCR and Southern blot, they harbored group 1 CPS operon with the related several genes being deleted with individual variance. On PCR and Western blot, they harbored several genes and proteins related to iron-uptake with individual variance. On 6 M urea-gel electrophoresis, they could utilize transferrin-bound iron with individual variance. On semisolid agar, they exhibited swarming motility with individual variance. In an adhesion assay, they adhered to HeLa P3 (S) cells with individual variance. In LDH assay, they exhibited cytotoxicity to HeLa P3 (S) cells with individual variance. On multi-well plates, they formed biofilm with individual variance. When relationship among these virulence traits was statistically analyzed, swarming motility was positively associated with adherence or cytotoxicity, and the three traits were negatively associated with biofilm formation. These results imply that T-type strains do not accompany the change of the other virulence traits and motility seems to play an important role in adhesion and cytotoxicity but inhibits biofilm formation in V. vulnificus.