뱀독으로부터 피브리노겐을 분해하는 단백질 분해효소의 분리 및 특성 분석

Abstract

뱀독은 항 응고 작용과 피브리노겐을 분해하는 활성을 지닌 여러가지 펩타이드 및 효소를 함유하고 있다. 본 연구에서는 Macrovipera mauritanica 뱀독으로부터 피브리노겐을 분해하는 단백질 분해효소를 정제하고 그 특성을 분석하였다. 이 분해효소의 정제에는 Superdex 75, Source Q 및 Mono Q 칼럼 등 세 단계의 크로마토그래피를 사용하였으며 정제한 효소를 MMF라 명명하였다. MMF는 단일 폴리펩타이드로 구성되었으며 약 27 kDa의 분자량을 가지고 있었다. MMF의 N-말단 아미노산 서열은 “NH2-QRFAPRYIEL-COOH”였다. 여러 가지 단백질을 기질로 사용한 결과, MMF는 피브리노겐을 가장 효과적으로 절단하는 단백질 분해효소였다. MMF는 피브리노겐의 알파와 베타사슬을 각각 20분과 8시간내에 모두 절단하는 특성을 지니고 있었다. 그러나 피브리노겐의 감마사슬은 MMF에 의해 절단되지 않았는데 이는 대부분의 뱀독 유래 피브리노겐 분해 단백질효소가 지니는 공통의 특성이다. 트롬빈과 혈액응고인자인 FXIIIa를 이용하여 교차연결시킨 피브린 또한 MMF에 의해 절단되었는데, 이 경우에서도 g-g 사슬은 MMF에 의해 절단되지 않았다. MMF가 절단된 약 17.5 kDa 크기의 피브리노겐 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, MMF는 Lys413과 Leu414를 연결하는 펩타이드 결합을 가수분해함을 확인하였다. MMF의 이 절단자리를 포함하는 아미노산 서열을 이용하여 Abz-His-Thr-Glu- Lys-Leu-Val-Thr-Ser-Lys-Dnp-NH2 서열을 지닌 형광성 펩타이드 기질을 합성하였다. 이 펩타이드 기질을 이용하여 MMF의 효소활성을 분석한 결과, KM값은 1.5 x 10-2 M/L였으며 분자활성은 0.31이었다. MMF의 효소 활성을 위한 최적의 pH는 약 5.5였으며, 최적 온도는 30℃였다. MMF의 효소 활성은 1.10-PT, DTT 및 EDTA에 의해 억제 되지만 TLCK, bestatin 및 aprotinin에 의해서는 억제되지 않았다. 이러한 결과는 MMF는 금속-함유 단백질 분해효소이며 MMF내의 이황화결합이 효소활성에 중요한 역할을 하고 있음을 제시하는 것이다. 기니피그를 이용한 혈관투과성 유도 특성을 분석한 결과, 10 mg의 MMF는 10분 후 혈관 투과성을 증가시켰으며, 유출된 색소양은 약 8 mg이었다. MMF는 또한 세포간질을 구성하는 콜라겐 IV를 분해하는 효소활성을 지니고 있었다. 이와 같은 결과는 MMF가 콜라겐 IV를 분해하여 혈관투과성을 증가시킬 가능성을 시사하는 것이다. 본 연구에서 얻은 이상의 결과들은 뱀독 유래의 MMF는 피브리노겐을 선택적으로 분해하는 금속-함유 단백질 분해효소임을 보여주는 것이다.|Snake venom contains various enzymes and peptides showing anticoagulant and fibrinogenolytic activities. In this study, a fibrinogenolytic enzyme designated to as MMF was purified and characterized from crude snake venom of Macrovipera mauritanica. For the purification, Superdex 75, Source Q, and Mono Q column chromatographic steps were employed in order. MMF was purified to homogeneity as judged by its migration profile in SDS-polyacrylamide gel stained with coomassie blue. The purified enzyme showed a molecular mass of about 27 kDa. MMF was composed of single polypeptide and its amino-terminal 10 amino acid sequence was found to be NH2-QRFAPRYIEL-COOH, identical to that of a fibrinolytic metalloproteinase from the venom of Vipera lebetina, except for the first amino acid glutamine. MMF could prolong 2.2 times the fibrinogen clotting time (FCT), compared to that of non-treated control. Among substrate proteins tested, fibrinogen was the most susceptible one for MMF. The a- and the b-chains of fibrinogen were completely digested by MMF until 20 min and 8 h at 37℃, respectively. As shown in other fibrinogenolytic enzymes from snake venoms, the g-chain of fibrinogen seemed to be resistant to the enzyme cleavage. The cleavage pattern on cross-linked fibrin by MMF was similar to the case of fibrinogen. MMF could cleave the peptide bond between Lys413 and Leu414 in the a-chain of fibrinogen. Based on the cleavage site of MMF, a fluorogenic peptide substrate was designed and synthesized as follows: Abz-His-Thr-Glu- Lys-Leu-Val-Thr-Ser-Lys-Dnp-NH2. Using the synthetic fluorogenic substrate, enzyme kinetics was determined as follows: KM = 1.5 x 10-2 M/L, Vmax = 2.33 x 10-7 M/min, and turnover rate = 0.31. The optimal pH and temperature for the enzyme activity of MMF were about pH 5.5 and 30℃, respectively. The enzyme activity of MMF could be inhibited by metalloproteinase inhibitors (1,10-PT, DTT, and EDTA), but not by serine protease inhibitors (TLCK and TPCK), suggesting that MMF may be a metalloproteinase. In addition, MMF increased vascular permeability as observed by Miles assay. MMF could partially cleave type IV collagen that is an extracellular matrix components in vitro. Taken together, the results obtained by this study suggest that MMF is a fibrinogenolytic metalloproteinase and also can induce vascular permeability through digesting type IV collagen.