해수에서 분리한 신규메탄올 산화세균 Methylophaga aminisulfidivorans MPT 유래 methanol dehydrogenase와 MxaJ 단백질의 상호관계 및 trimethylamine biosensor 개발
- Author(s)
- 김희곤
- Issued Date
- 2008
- Keyword
- Methylophaga aminisulfidivorans MPT|methanol dehydrogenase|trimethylamine biosensor
- Abstract
- A new restricted facultatively methylotrophic marine strain MPT (KCTC 12909T= VKM B-2441T = JCM 14647T) possessing the ribulose monophosphate pathway of C1-carbon compound assimilation was isolated from a seawater sample obtained from Mokpo, South Korea. The isolate was aerobic, Gram-negative, asporogenous, and was non-motile short rod. It grew well on methanol, methylated amines, dimethylsulfide and dimethylsulfoxide. Optimal growth occurred with 3% NaCl at 30oC and pH 7.0. Fructose was utilized as a multicarbon source. Growth factors were not required and vitamin B12 did not stimulate growth. Its cellular fatty acid profile consists primarily of straight-chain saturated C16:0 and unsaturated C16:1 acids. The major ubiquinone is Q-8. The dominant phospholipids are phosphatidylethanolamine and phosphatidylglycerol. The DNA G + C content is 44.9 mol% (Tm). Based on 16S rRNA gene sequence analysis and DNA-DNA relatedness (25 ~ 41%) with the type strains of marine methylotrophs belonging to the genus Methylophaga, we proposed the isolate MPT (= KCTC 12909 = VKM B-2441 = JCM 14647) be assigned as Methylophaga aminisulfidivorans sp. nov.
Methylophaga aminisulfidivorans MPT, a restricted facultative marine methylotrophic bacterium, was able to utilize methanol as a sole carbon and energy source, and possessed a methanol dehydrogenase (MDH) that is a key enzyme in the process of methanol oxidation. During purification of MDH, two types of MDH (MDH I and II) were obtained in the cell free extracts from MPT cells grown on methanol. When analyzed by SDS-PAGE and ESI-FT ICR MS, MDH I was confirmed to consist of two subunits of with molecular masses of ~66 and ~10 kDa, respectively, in a form of ?2?2. By contrast, MDH I and MDH II contained an additional ~30 kDa protein, designated ?, in a form of ?2?2? and ?2?2?2, respectively. MDH II showed 1.5?2.0 times higher activity than MDH I. Based on these observations and experimental data, it seems that the original MDH conformation is ?2?2?2 within MPT, and subunit ? keeps MDH in an active form, and/or makes MDH easily bind to the substrate, methanol.
Methylophaga aminisulfidivorans MPT could be grown aerobically on trimethylamine (TMA) as a source of carbon and energy. The trimethylamine dehydrogenase (TMADH) could catalyze the oxidative demethylation of TMA. The active TMADH from MPT was purified 12.3 fold through three purification steps. We detected the trimethylamine using an electrochemical biosensor with the electron-conducting redox polymers, Osmium and Ferrocene-imidazole complexes were electrode posited on the thiol-modified gold electrodes. As TMA was catalyzed by TMADH, the electrical signal obtained from a biosensor was monitored at 0.3 V versus Ag/AgCl. The produced electrons were transferred to the electrode via Ferrocene-imidazole complexes. The detection limit of TMA biosensor was 0.125 mM. The intensity of catalytic current almost linearly increased depending on the TMA concentrations.
- Alternative Title
- Interaction between methanol dehydrogenase and MxaJ protein of a novel methanol oxidizing bacterium, Methylophaga aminisulfidivorans MPT and development of trimethylamine biosensor
- Alternative Author(s)
- Kim, Hee Gon
- Affiliation
- 조선대학교 대학원 생물신소재학과
- Department
- 일반대학원 생물신소재학과
- Advisor
- 김시욱
- Awarded Date
- 2008-08
- Table Of Contents
- 제1장 메탄올 산화세균의 순수 분리 = 1
제1절 연구배경 및 중요성 = 1
제2절 실험 재료 및 방법 = 8
1. 균주의 분리 및 동정 = 8
가. 기본 배지의 조성 = 8
나. 균주의 분리 방법 = 8
다. 우수균주의 선별 = 8
라. 분리 균주의 특성 조사 = 9
(1) 형태 및 배양학적 특징 = 9
(2) 에너지 및 탄소원으로 이용할 수 있는 기질의 범위 = 9
(3) 질소원의 영향 = 10
(4) 배양 온도 및 초기 pH 영향 = 10
(5) 균체 비생장속도와 세대시간 = 10
(6) 세포벽의 구조 및 운동성 여부 = 10
(7) Catalase와 oxidase 활성 측정 = 11
(8) 분리균주의 fatty acid 구성 및 ubiquinone 분석 = 11
(9) 3-Hexulose phosphate synthase의 활성측정 = 12
(10) G+C mol% = 12
(11) Chromosomal DNA의 분리 = 13
(12) 16S rDNA 분석 = 13
(13) Plasmid의 존재여부 = 14
제3절 결과 및 고찰 = 15
1. 실험균주의 분리 및 특성 = 15
가. 분리균주의 형태 및 배양학적 특징 = 15
나. 이용 가능한 기질 및 질소원 = 15
다. 분리 균주의 최적 배양 조건 = 17
라. 균의 비생장 속도와 세대시간 = 22
마. 생리 생화학적 특징 = 22
바. Methanol과 methylamine에서 배양한 균주의 효소학적 특징 = 22
사. 분리 균주의 분자생물학적 특성 = 26
제4절 결론 = 29
제5절 참고문헌 = 30
제2장 Methylophaga aminisulfidivorans MPT의 methanol dehydrogenase와 MxaJ 단백질의 상호 관계 = 34
제1절 연구배경 및 중요성 = 34
제2절 실험 재료 및 방법 = 40
1. 시약 및 기기 = 40
2. 세균 배양 조건 = 40
3. Methanol dehydrogenase (MDH) 정제 = 40
가. 초음파 파쇄기를 이용한 cell free extract의 제조 = 40
나. MDH 효소 정제 = 41
다. Lysozyme을 이용한 cell free extract 제조 = 43
라. Gel filtration chromatography = 43
마. MDH 효소 활성 측정 및 단백질 정량 = 44
바. SDS-PAGE를 통한 MDH 효소 정제도의 확인 = 44
사. Native PAGE 및 활성염색 = 44
아. 등전점의 측정 = 44
자. N-말단 아미노산 서열 결정 = 45
차. EST-FT ICR mass spectrometry = 45
4. Genomic library 구축 = 46
가. Southern blot analysis = 46
나. MxaFJGIR 메탄올 산화 유전자의 분석 = 46
(1) 염기 서열의 분석 = 46
(2) Total RNA의 분리 = 46
(3) RT-PCR을 통한 mxaFJGI 유전자 발현 양상 조사 = 47
5. 항체의 제조 및 정제 = 48
가. 항체의 제조 = 48
나. 항체의 정제 = 48
다. Western blot analysis = 49
6. MDH와 MxaJ 단백질간의 상호 작용 = 49
가. MxaJ 단백질의 발현 및 MDH와의 결합 = 49
나. Co-immunoprecipitation = 50
다. MxaJ 항체를 이용한 MDH 활성 저해 실험 = 50
제3절 결과 및 고찰 = 52
1. Methanol dehydrogenase의 분리 및 정제 = 52
2. MDH I과 MDH II 단백질의 특성 분석 = 56
3. MDH I과 MDH II의 subunit 구조 분석 = 61
4. MxaFJGIR cluster 분석 = 63
5. MxaJ와 native MDH의 in vitro binding assay = 69
가. Native MDH I과 MxaJ 단백질의 direct binding assay = 69
나. Co-immunoprecipitation = 69
6. Methanol oxidation gene의 transcript 분석 = 73
7. MDH와 cytochrome cL 그리고 MxaJ 간의 상호 작용 = 73
8. MxaJ 단백질과 MDH의 활성간 상관관계 = 80
가. MxaJ 항체를 이용한 MDH 활성 저해 실험 = 80
나. Sonication에 의한 MDH II 단백질의 활성변화 = 80
제4절 결론 = 83
제5절 참고문헌 = 85
제3장 Methylophaga aminisulfidivorans MPT의 trimethylamine dehydrogenase를 이용한 trimethylamine biosensor 개발 = 89
제1절 연구개발의 필요성 = 89
제2절 재료 및 방법 = 95
1. TMADH 효소 순수 분리 및 정제 = 95
가. Soluble fraction 제조 = 95
나. Anion exchange column (POROS 20 HQ) chromatography = 95
다. Hydrophobic (HiPrep 16/10 Phenyl) chromatography = 95
라. Gel filtration (Sephacryl S-200) chromatography = 95
2. Trimethylamine dehydrogenase의 특성조사 = 96
가. 효소활성 측정 = 96
3. TMADH 효소를 이용한 전기화학적 분석시스템 구축 = 96
가. 전기전달매개체 (PVI-Os)를 이용한 trimethylamine의 분석 = 96
나. Mediator 제조 = 99
다. 전기화학실험을 위한 electrode의 제작 = 102
(1) 스크린 프린팅 탄소 전극의 제작 = 102
(2) Carbon electrode를 이용한 trimethylamine 정량 = 102
(3) Cyclic voltammetry 측정 = 102
(4) 탄소전극위에 금 나노입자의 전기흡착 (electrodeposition) = 102
제3절 결과 및 고찰 = 105
1. Trimethylamine dehydrognase 정제 및 특성 조사 = 105
가. TMADH의 정제 = 105
나. TMADH 특성 조사 = 105
(1) 최적온도, 온도 안정성 및 최적 pH = 105
(2) Km과 Vmax 결정 = 105
2. TMADH를 이용한 TMA의 전기화학적 분석 = 108
가. 전극위에 금 나노입자의 전기흡착 실험 = 108
나. 전극위에 redox complex의 고정화 실험 (Self Assemble Monolayer; SAM) = 108
다. 전기전달매개체를 이용한 TMA의 분석 = 110
(1) PVI-Os를 이용한 다양한 농도의 trimethylamine 검출 = 112
(2) Ferrocene 화합물을 이용한 다양한 농도의 trimethylamine 검출 = 111
제4절 결론 = 115
제5절 참고문헌 = 116
- Degree
- Doctor
- Publisher
- 조선대학교 대학원
- Citation
- 김희곤. (2008). 해수에서 분리한 신규메탄올 산화세균 Methylophaga aminisulfidivorans MPT 유래 methanol dehydrogenase와 MxaJ 단백질의 상호관계 및 trimethylamine biosensor 개발.
- Type
- Dissertation
- URI
- https://oak.chosun.ac.kr/handle/2020.oak/7387
http://chosun.dcollection.net/common/orgView/200000236708
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Appears in Collections:
- General Graduate School > 4. Theses(Ph.D)
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- Embargo2008-07-18
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