The study of physiological role of p53R2

Abstract

p53R2는 새로 발견된 ribonucleotide reductase의 작은 subunit로서 p53에 의존하는 방식으로 DNA 의 손상 수복 및 사립체 DNA복제에 전구물질을 제공하는데 중요한 역할을 한다. p53R2의 생리적 역할에 대한 연구가 최근에 활발이 진행되지만 아직까지는 완벽히 해석이 되지 않고 있다. 본 연구에서 우리는 단백질의 안정성 및 종양의 전이 등 역할과 연관된 단백질들이 p53R2와 상호 결합한다는 것을 Y2H선별을 통해서 발견하였고, 이런 단백질이 상호결합을 초점으로 p53R2의 생리학적 역할의 분자생물학적 기전을 밝히려고 했다. 우선 우리는 p53R2가 단백질이 안정성에 연관된 단백질인 Skp1A, Jab1과 결합을 연구하였다. Skp1A는 ubquitin 단백질분해효소인 SCF복합체의 구성성분중의 하나이다. Jab1은 세포핵에서 p53을 운반해 내오고 세포질에서 p53을 분해시키는 작용을 한다. 이 두 가지 단백질과 p53R2와의 결합을 면역침전 방법으로 확인하였다. p53R2은 DNA 손상시키는 물질에 의해서 p53에 의존하는 방식으로 생성되지만 어떻게 분해되는지는 아직 알려진 바가 별로 없다. 우리는 HEK293T세포에서 p53R2가 생체에서 존재하는 시간이 짧은 단백질이고 반감기가 30분 미만이며 세포에서 proteasome 억제제 MG132를 사용시 이런 p53R2의 분해가 억제된다는 것을 증명하였다. 체내와 체외 ubquitin 검측을 통해서 우리는 p53R2는 분해는 ubiquitin 경로를 통해서 진행된다는 것을 증명 하였다. 이러한 p53R2의 ubquination은 SCF 복합체 조성성분인 Skp1A와 Cullin1이 필요하다. p53R2는 p53에 의해 조절되며 p53과의 결합서열을 갖고 있다. 추가로 우리는 p53R2가 Jab1과 결합하는 것을 이미 면역침전방법으로 확인했다. 포유동물의 세포에서 p53R2의 발현을 억제시켰을 경우 여러 가지 사람세포에서 p53의 반감기가 줄어들었고 과발현 시켰을 경우 p53의 ubiquitination은 p53R2양에 따라 증가하는 것을 볼 수가 있었다. 우리는 siRNA을 이용하여 p53R2발현을 억제시켰을 경우 핵에서 세포질로의 p53의 운반은 증가된다는 것을 보여주었고 이러한 운반은 Jab1에 의해 연관 되였다는 것을 증명하였다. 이로부터 우리는 p53R2는 p53의 전사타깃인 동시에 또 p53의 안정성을 조절한다는 것을 알게 되였다. 그 다음으로 우리는 Y2H에 의해서 선별된 MEK2라는 종양의 전이와 연관있는 단백질이 p53R2와 상호결합을 연구하였다, 최근까지 p53R2가 종양의 전이와 연관이 있을 거라는 연구가 진행 되여 왔지만 그 메커니즘은 아직 밝혀진 바가 없다. 우리는 p53R2가 종양의 전이나 침범에 연관된 MAPK의 한 개 조성성분인 MEK2와 결합하는 면역침전방법으로 확인하였다. 두 단백질의 결합은 p53R2의 아미노산 160-306사이에 결합하고, Erk-MAPKinase 활성을 조절한다, p53R2발현을 억제시키면 Erk1/2의 인산화가 증가되고 p53R2를 과발현 했을 경우 인산화가 억제된다, 순차적으로 p53R2발현을 억제시키면 세포의 침범을 증가하고 p53R2를 과발현하면 종양세포의 침범을 억제한다. p53R2의 Erk-MAPKinase 신호경로에 대한 억제작용은 MEK2의 인산화를 억제시켜서 한다. 이는 p53R2의 종양의 전이와 침범을 억제하는 메커니즘이다. 위의 결과로부터 p53R2는 여러 가지 역할을 가진 단백질로서 어떤 단백질과 결합하는가에 따라 세포의 생존, DNA 손상 수복, 종양세포의 성장과 침범 등에 중요한 역할을 한다. p53R2의 분자생물학적 역할을 연구하는 것은 이러한 생리학적 기능의 연구에 도움이 될 것 이다.|p53R2 is a newly identified small subunit of ribonucleotide reductase (RR) and plays a key role in supplying precursors for DNA repair and mitochondrial DNA replication. Many studies on physiological function of p53R2 were done recently, however not fully elucidated. In this study, we found some very important proteins related to protein stability, and tumor metastasis, were interacted with p53R2 by Yeast-2-hybrid screening. We focused on these proteins interactions to understand molecular mechanism of physiological function for p53R2. Firstly, we studied for two protein related with protein stability, Skp1A and Jab1. SKIP1A is one component of SCF(the Skip1-Cullin-F-box)complex(ubiquitin protein ligase). Jab1 is a nucleus exporter and inducer of cytoplasmic degradation for p53. We confirmed interactions of two proteins by immunoprecipitation in mammalian cells. p53R2 induced by some DNA damage agents, in p53-dependent manner, however little is known degradation of p53R2. We demonstrated that p53R2 is a short-lived protein, half-life is less than 30min in living HEK293T cells, and p53R2 degradation is inhibited by proteosome inhibitor MG132. in vitro and in vivo ubiquitination assay elucidate that p53R2 protein is degraded by ubiquitin pathway in HEK293T cell; and this degradation of p53R2 were required two components of SCF complex, Skp1A and Culin1. p53R2, is regulated by tumor suppressor p53, and p53R2 contains a p53-binding sequence. In mammalian cells silencing p53R2, accelerated p53 degradation, and decreased the half-life of wild-type p53; and overexpression of p53R2 inhibited ubiquitination of exogenous p53 in a dose-dependent manner, whereas knocking down p53R2 by siRNA enhanced ubiquitination of endogenous p53. In addition to our study, p53R2 were binding with Jab1. We showed that silencing p53R2, increased transport of p53 from nucleus, and this exclusion mediated by Jab1. These results suggest that as the transcriptional target of p53, p53R2 regulated p53 stability via Jab1. , Secondly, we studied for MEK2 related with tumor metastasis. Although some studies are going on the metastasis-suppressing property of p53R2, recently, mechanism of metastasis-suppressing property of p53R2 is not clear yet. we confirmed that p53R2 interacted with MEK2 by immunoprecipitation, which is a component of Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK) which signal were associated with tumor invasion and metastasis. Then amino acids 160 to 306 of p53R2 are critical for interacting with MEK2. Binding of p53R2 with MEK2, modulate Erk-MAPKinse pathway, silencing p53R2 increased phosphorylation of erk1/2, while overexpression of p53R2 decreased phosphorylation of erk1/2; which susquencialy promote cell invasion by silencing of p53R2, while overexpression of p53R2 inhibit cell invasion, cell transformation. p53R2 Inhibited Erk-MAPKinase signal via inhibiting phosphorylation of MEK2 , which affect Erk-MAPKinase pahway resulted in p53R2 metastasis-suppression property. All these results suggested that p53R2 is a multi-functional protein, which had many physiological functions based on interacting with some important proteins related with cell survival, DNA repair and so on. Understanding the molecular mechanism of p53R2 function will be significant, not only on DNA repair and replication, but also cell survival, tumor metastasis and so on.