Amyloid beta peptides (1-40, 1-42); Purification, effects of their combinations, and a chaperone protein

Abstract

본 연구에서는 재조합 amyloid beta peptides (Aβs)를 효율적으로 대량생산하는 방법을 개발하였다. 발현시키고자 하는 단백질은 GroES와 융합단백질로 봉입체로 형태로 과발현시켰으며 deubiquitylating 효소로 절단하고 4M urea로 융해시킨 후 분리하였다. 이 방법은 화학적인 합성이 어렵고 생물학적으로 분리가 어려운 펩타이드를 효율적으로 분리하는 방법이다. 다음으로 샤페론 단백질 Dnak의 Aβ aggregation과 세포독성에 미치는 영향을 여러 가지 다른 조건에서 관찰하였다. DnaK/ Aβ42가 0.01~0.1의 비율로 존재할 때 중합체의 축적 및 독성이 높게 나타나지만 0.5이상의 비율에서는 상대적으로 축적이 일어나지 않는다. 특히 세포독성은 중합체의 축적이 일어남으로써 증가하고, 상대적으로 Dnak가 높은 비율로 존재할 때 세포독성이 줄어든다. 결과적으로 샤페론은 Aβ 단량체에서 중합체로의 구조적인 전환에 영향을 미치며 Aβ 중합체의 증가와 감소는 세포독성에 영향을 미친다. 이어 Aβ42/Aβ40의 비율이 Aβ의 축적과 세포 독성에 미치는 영향을 Flemish와 Dutch 돌연변이 펩타이드를 이용하여 관찰하였다. 정상적인 단량체 Aβ42/ Aβ40의 비율이 0에서 8로 증가할 때 Aβ의 축적 및 세포독성이 증가되었지만 단량체의 비율이 20에서 40로 증가할 때 Aβ의 축적 및 세포독성은 상대적으로 감소한다. Aβ42/Aβ40의 비율이 0에서 20일 때 돌연변이 Flemish 펩타이드는 Aβ의 축적 및 세포독성을 감소시키는데 비해 Dutch 돌연변이 펩타이드는 증가시킨다. 따라서 정상적인 Aβ42/Aβ40의 비율과 유전성 돌연변이 펩타이드는 Aβ의 축적 및 세포독성이 상이하여 서로 다른 임상적 특징을 갖게 된다. 한편 정상적인 Aβ40와 Dutch 돌연변이 Aβ40의 혼합물을 이용한 실험 결과로 Dutch 돌연변이 Aβ40만 존재할 때 보다 용해성 중합체를 축적시키고 용해성이 높은 형태의 Aβ40로 유지시키는 것을 관찰하였다. 이는 Dutch 돌연변이 관련질병인 Cerebral amyloid angiopathy (CAA)과 관계있는 것으로 사료된다.|An efficient method has been developed to produce large amounts of recombinant amyloid beta peptides (Aβs). A fusion protein consisting of GroES, ubiquitin (as a cleavage site) and target peptide was overexpressed as inclusion bodies. Aβs were purified after solubilization of fusion protein in urea and cleavage by a deubiquitylating enzyme (Usp2-cc), which maintained its activity even in the presence of up to 4 M urea, by a single step of chromatography. This system is a convenient tool for the production of peptides that are difficult to be chemically synthesized and biologically purified. Next, the effects of chaperone protein DnaK on AΒ aggregation and cytotoxicity were investigated in different conditions. A significant amount of oligomeric species of AΒ that is believed to be more toxic than other AΒ structures was accumulated at 0.01~0.1 ratios of DnaK/AΒ42, while such accumulation was not observed with the higher ratio (>0.5). Importantly, the cytotoxicity was enhanced concomitantly with the accumulation of the oligomeric forms and, in contrast, cytoprotection was observed at excess molar of DnaK. Results indicate that the chaperone influences AΒ structural transitions from the oligomer to the fibrillar structures as well as from the monomers to the oligomers with variable rates, and as results, it increases or decreases the amount of the AΒ oligomer and concomitantly the cytotoxicity. Further, role of AΒ42/ AΒ40 ratios on AΒ aggregation and cytotoxicity was investigated, and compared with Flemish and Dutch mutant peptides. When Wild AΒ40/ AΒ42 monomer ratios were increased from 0 to 8, an increased level of AΒ aggregation and concomitant toxicity was observed. Whereas further increase in Wild AΒ40/ AΒ42 monomer ratios from 20 to 40, prevented the AΒ aggregation as well as toxicity. On the contrary, Flemish mutant peptide showed reduced but Dutch mutant peptide showed enhanced AΒ aggregation and toxicity on increasing their respective AΒ40/ AΒ42 ratios from 0 to 20. This data suggest that AΒ42/ AΒ40 ratios of Wild type peptide and pathogenic mutant variants affect AΒ aggregation and toxicity differently and thus it could be one possible reason for their differential clinical features. In addition, mixtures of Wild AΒ40 and Dutch mutant AΒ40 were examined. Using thioflavin-T-binding assay, MTT assay, TEM and Size exclusion chromatography, it was elucidated that mixtures of Wild?type AΒ40 and Dutch mutant AΒ40 accumulated soluble oligomers, which stayed longer in soluble form compared to Dutch mutant AΒ40 alone, implicating the possible role of oligomers apart from fibrillar forms of Dutch AΒ40 in cerebral amyloid angiopathy (CAA).