DNA 프로브 Pn23 핵산염기서열을 기반으로 한 Prevoella nigrescens의 검출을 위한 PCR 프라이머 개발

Abstract

최근의 연구에서 무작위 클로닝법과 Southern blot hybridization법에 의해 Prevotella nigrescens(P. nigrescens)를 종-특이적으로 검출할 수 있는 Pn23 DNA 프로브가 보고되었다. 본 연구는 Pn23 DNA 프로브의 핵산염기서열을 바탕으로 하여 P. nigrescens 균주들을 종-특이적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머를 개발하고자 시행되었다. Pn23 DNA 프로브의 핵산염기서열을 바탕으로 PCR 프라이머를 설계하였고, 프라이머의 종-특이성을 검증하기 위하여 임상에서 분리된 P. nigrescens 10 균주와 P. intermedia 6 균주, 그리고 20 종의 Prevotella spp.에 대한 표준균주 및 참고 균주의 지놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 또한 각 PCR 프라이머의 민감도를 측정하기 위하여 지놈 DNA 4fg부터 4ng까지 PCR 주형으로 사용하였다. PCR 프라이머 Pn23-F1/Pn23-R1 쌍 및 Pn23-F2/Pn23-R2 쌍들은 본 연구에서 사용된 모든 P. nigrescens 균주들을 종-특이적으로 검출하였으며, PCR 프라이Pn23-F6 /Pn23-R6쌍 및 Pn23-F7/Pn23-R7 쌍들은 P. nigrescens ATCC 33563^(T)만을 균주-특이적으로 검출하였다. 프라이머 각각에 대한 P. nigrescens ATCC 33563^(T) 지놈 DNA량의 검출 한계를 알아보기 위한 민감도 실험결과, 네 가지 프라이머는 각각 0.4pg 또는 4pg까지 검출 가능하였다. 이상의 연구결과를 종합할 때, Pn23-F1/Pn23-R1 및 Pn23-F2/Pn23-R2 PCR 프라이머 들은 P. nigrescens를 종-특이적으로 검출할 수 있는 구강세균 진단킷트 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 Pn23-F6/Pn23-R6와 Pn23-F7/Pn23-R7 PCR 프라이머들은 숙주-세균 상호작용을 연구하는데 주로 이용되는 P. nigrescens 표준균주인 ATCC 33563^(T) 균주를 신속하고 정확하게 검출하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.|In a previous study, a Prevotella nigrescens (P. nigrescens)-specific DNA probe, Pn23, was cloned by shotgun method and southern blot hybridization. The purpose of this study was to develop the P. nigrescens species-specific PCR primers based on the nucleotide sequence of Pn23 DNA probe. The specificity was tested aganist 10 clinical isolates of P. nigrescens, 6 clinical isolates of P. intermedia and 20 type strains of oral bacteria. The sensitivity of PCR primers was determined by testing serial dilutions of the purified genomic DNA of P. nigrescens ATCC 33563^(T) as a standard strand. The data showed that the two sets of PCR primers, Pn23-F1/Pn23-R1 and Pn23-F2/Pn23-R2 had the species-specificity and the two sets of PCR primers, Pn23-F6/Pn23-R6 and Pn23-F7/Pn23-R7, had the strain-specificity for the P. nigrescens ATCC 33563^(T). The detection limits of four primer sets was 0.4 pg～4 pg of the purified genomic DNA of P. nigrescens ATCC 33563^(T). These results suggested that the two sets of PCR primer, Pn23-F6/Pn23-R6 and Pn23-F7/Pn23-R7, could be useful in the quick identification of P. nigrescens ATCC 33563^(T) and particularly helpful in the confirmation of the strain. Moreover, the two sets of PCR primer, Pn23-F1/Pn23-R1 and Pn23-F2/Pn23-R2, could be useful in the development of PCR kit for the epidemiological studies and bacteriological diagnosis or prognosis for the endontitis and periodontitis.