In vivo bioluminescence imaging of rat cardiomyoblast transplantation

Abstract

증여세포의 사멸 및 재주입은 정상세포와 이식한 줄기세포의 결합이 기본적으로 제한되어져 있다. 현재 이식되어진 세포의 생존은 새로운 광학영상기법을 이용하여 볼 수 있다. 본 실험은 murine 의 넓접골격 근육에 심근세포를 이식한 후 세포생존 모니터를 생물발광 영상 기법을 이용하는데 목적이 있으며, 또한 숙주 변역세포의 거부반응을 막기 위해 여러 개의 면역 억제재를 적용하였다. Rat 배아심근세포를 표지 유전자인 firefly luciferase 가 포함되어 있는 아데노바이러스를 이용하여 감염시켰으며, 1, 10, 100 의 MOI 를 가진 아데노바이러스를 사용하여 murine (n=9 per group)의 근육세포내에 intramuscular injection 방법으로 바이러스가 감염된 세포를 1×10^(1) 부터 5×10^(6) 주입하였다. 면역억제 치료로서 배아심근세포를 이식한 후 3 일째부터 mice 와 rat 에 Cyclosporine (5mg/kg/day) or Tacrolimus (1mg/kg/day) or Dexamethasone (4mg/kg/day) 같은 면역억제제를 가지고 일시적으로 면역억제를 수행하였다. 생물발광영상은 Xenogen company 에서 구입한 in vivo imaging system 를 이용하여 매일 영상을 획득하였다. BSA protein assay 를 통하여 단백질을 정량화 한 후 luciferase assay kit 를 이용하여 luciferase 의 활성도를 측정하였다. 감염다중도가 100 인 바이러스를 형질 도입한 배아심근세포를 5×10^(6) 골격근육에 이식한 그룹에서 최적에 감염효율을 야기하였다. 면역억제제를 투여한 nude mice 에서 Tacrolimus 와 Cyclosporine 이 이와 같이 (day 4:2.71E+07 (Tac), 9.47E+07 (CsA), 5.25E+07 (Dex), and 1.25E+07 p/s/cm2/sr (cortrol); day 30: 4.31E+05 (Tac), 1.24E+05 (CsA) and 1.09E+04 p/s/cm2/sr (Dex) 성공적으로 세포손실을 성공적으로 억제함을 확인하였으며 30 일 동안이나 생물발광영상을 통하여 firefly luciferase 의 발현을 보여주었다. Balb/c 에서도 역시 Tacrolimus 와 Cyclosporine 같은 면역억제제를 이용한 그룹이 정상그룹보다 오랫동안 세포가 생존해 있음을 영상을 통하여 8일 동안 확인하였다. rat에서는 면역억제제를 사용한 그룹에서는 25일 동안. 약물을 사용하지 않은 정상그룹에서는 6 일까지만 새포가 생존해 있음을 영상으로 확인하였다. 이러한 실험을 통하여 심근세포를 이식하는 동안 약물을 이용하여 면역내성을 유도하여 murine 골격근육에 이식되어진 증여세포의 생존율을 향상 시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한 이러한 세포생존을 in vivo imaging system 과 같은 영상기기 장비를 이용한 생물발광 영상을 통하여 이식된 심근세포의 생존기간을 비침습적, 반복적으로 모니터 할 수 있는 잠재성을 보여주었다.|The rapid donor cell death and rejection are basic limitations encountered in normal and stem cell transplantation. Nowadays, me survival of transplanted cells can be visualized using a novel optical imaging technique. Our study aimed to use the bioluminescence imaging technique to monitor the cardiomyoblasts transplanted into murine skeletal thigh muscles, together with the applications of some immunosuppressive agents to prevent the rejection of host immune system. Embryonic rat cardiomyoblasts were transfected with Fluc reporter gene-containing adenovirus in different multiplicity of infection (1, 10, 100) and cell doses (1×10^(4) - 5×10^(6)), followed by the intramuscular injection into murine skeletal muscle (n=9 per group). In immunosuppressive therapy, mice and rats underwent transient immunosuppression with either Cyclosporine (5mg/kg/day) or Tacrolimus (1mg/kg/day) or Dexamethasone (4mg/kg/day), beginning on day -3 of implantation. Bioluminescence imaging was then daily carried out using a cooled CCD camera (Xenogen). Luciferase activity was measured by luciferase assay and normalized to the protein amount determined by protein assay. Viral transduction at MOI 100 and the 5×10^(6) cell-dose implantation resulted in optimal transfection efficiency. Nude mice received immunosuppressive agents displayed the long-term Fluc expression for 30 days, in which Tacrolimus and Cyclosporine successfully suppressed the cell loss (day 4: 2.71E+07 (Tac), 9.47E+07 (CsA), 525E+07 (Dex), and 1.25E+07 p/s/cm2/sr (control); day 30: 4.31E+05 (Tac), 1.24E+05 (CsA) and 1.09E+04 p/s/cm2/sr (Dex)). In Balb/c mice, Tacrolimus and Dexamethasone also kept cells alive until day 8 as compared with the signal reduction up to day 6 of control mice. Bioluminescence expressed for 25 days in rat with immunosuppressants and 6 days in rat without drugs. From this study, the induction of immune tolerance using pharmaceutical agents during cardiomyoblast transplantation improved the donor cell survival in murine skeletal muscles. Utility of bioluminescence imaging resulted in a potential to noninvasively and repetitively monitor implanted cardiac myoblasts over time.