The Study of Ku80 in the protection of corneal cells from UV-irradiatio

Abstract

세포 내외의 유해인자에 의해 DNA 가 손상되면 세포내부에 존재하는 신호전달체계에 의하여 DNA 복제가 정지된 후 손상된 DNA 는 DNA repair system 인 base excision repair, nucleotide excision repair 그리고 mismatch repair 에 의하여 repair가 이루어진다고 알려져 있다. 이런 손상된 유전자는 유전자손상 복구 시스템은 정교한 시스템에 의하여 조절되지만 아직 그 정확한 조절 기작은 알려져 있지 않다. 세포 신호 전달에 관여하는 Ras는 방사선에 의한 세포 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 각막세포에 흔히 손상을 주는 자외선을 보호하는 기작을 규명하고자 각막세포에 Ras 를 발현 시켜서 자외선에 의한 각막세포의 보호 효과 및 그 기작을 관찰 하였다. 본 연구 결과 ras 가 발현된 각막세포가 자외선에 의한 세포 손상이 억제된다는 사실을 확인하였다. 자외선은 유전자 이중 절단이 증가하여 세포를 죽음에 이르게 한다. 본 연구에서는 ras 가 발현된 각막세포에서 유전자 이중 절단을 복구시키는 Ku80의 발현이 증가된다는 사실을 northern blot과 western blot으로 확인하였다. 또한 이중 절단된 올리고를 기질화하여 측정 한 결과 ras 발현 세포에서 대조군 세포에 비하여 현저하게 유전자 이중 나선 부위에 단백질 결합이 증가하는 현상을 관찰하였다. 더욱이 자외선 조사 후 남아 있는 유전자 이중 절단을 측정한 결과 ras 발현 각막 세포에서 현저하게 유전자 이중 절단이 감소한다는 사실을 규명하였다. Ku80 은 세포의 DNA-Pk 활성을 증가하는 것으로 알려져 있기 때문에 ras 발현세포가 ku80 을 증가시켜 DNA-PK 활성을 증가시키는지를 관찰하기 위하여 대조군과 ras 발현 세포에서 DNA-PK 활성을 측정한 결과 예상대로 ras 발현세포에서 현저하게 DNA-PK활성이 증가함을 관찰하였다. 마지막으로 siRNA를 이용하여 ras 발현 세포에서 ku80을 제거한 경우에는 ras가 발현되더라도 자외선에 의한 각막 보호효과가 사라진다는 사실을 관찰 하였다. 이와 같은 실험결과를 종합하면, ras 발현 각막세포는 유전자 복구 단백질인 Ku80 의 발현을 증가시켜 자외선에 의한 각막세포 손상을 보호하는 것으로 사료된다.|The Ras activation contributes to UV resistance but the mechanism is unclear. This paper shows that the expression of the dominant-positive H-Ras increased the Ku80 level, which is one of the key enzymes involved in repairing double-stranded DNA breaks (DSBs). After exposing the cells to ionizing radiation and analyzing them using an electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) and pulsed-field gel electrophoresis, it was found that activated H-Ras expression in corneal cells increases the DNA binding activity of Ku80 and increases the DSB repair activity. Ku80 small interfering RNA expression was shown to reduce the oncogenic H-Ras-mediated increase in the DSBs and suppress the oncogenic H-Ras-mediated resistance of the cells toUV irradiation, while Ku80 overexpression in the corneal cells significantly increased the UV resistance. These results suggest that the Ku80 expression induced by oncogenic H-Ras appears to play important role in protecting cells against UV irradiation.