Development of Novel Peptide Inhibitors of Cytosolic Phospholipase A2α

Abstract

Phospholipase A2s（PLA2）는 인지질의 sn-2 위치에서 에스테르기를 가수분해한다．PLA2에 의한 세포막에서의 아라키돈산의 방출은 프로스타글란딘들, 류코트린들, 그리고 다른 에이코사노이드들의 변환들에 의해서 염증을 야기하는데 중요한 역할을 한다. 다른 PLA2들과 달리 85 kDa의 크기의 cytosolic phospholipase A2의 이성질체들 중에서 cPLA2α는 아라키돈산을 포함하는 인지질들 중에서 유일하게 특이성을 가진다. 또한, 이 효소는 대부분의 세포들과 조직들에서 발견되고며 마이크로몰 농도의 칼슘이온들에 의해 조절된다. 또한 cPLA2α는 천식, 관절염과 다른 염증관련 병들과 관련이 있다고 알려져 있다. 따라서 새로운 염증치료 약물들의 개발에 있어 매혹적인 치료적인 목표로써 생각되어진다． 이번 연구에서는, 인간의 cPLA2α유전자를 클로닝하였으며 그 유전자를 HEK293 세포에 과발현시켰다. 안정한 세포 주를 만든 것을 확인하기 위하여 간단한 측정법인 RT-PCR을 이용하였다. cPLA2α 단백질은 0.2～0.4 M 농도의 NaCl에서 Q-sepharose를 이용하여 크로마토그래피를 수행하여 부분정제 하였다. 파아지 디스플레이 방법으로 펩타이드를 선별하였다. 7개짜리 파아지 라이브러리의 패닝 과정을 거쳐서 펩타이드의 시퀀스를 얻어내었다. 새로운 펩타이드들인 PLA4, PLA5 그리고 PLAC는 cPLA2α에 대한 억제제를 확인하였다. 펩타이드들을 합성한 후 cPLA2α에 대하여 활성을 측정하였다. U937 세포를 분화시킨 후 아라키도닉산을 3H로 라벨을 붙인 세포막들을 이용 효소와 세포막을 부분적으로 분리하여 cPLA2α에 대한 활성을 측정하였다. 펩타이드들은 인간 적혈구에 처리하였을 때 혈액 용혈성이 나타나지 않았다. 게다가 PLA4, PLA5 그리고 PLAC를 HaCaT 세포에 처리했을 때 낮은 수준의 세포내 독성을 보였다. 세 번의 패닝 결과로 cPLA2α에 결합하는 펩타이드가 보존서열을 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 그리고 그 펩타이드들이 세포 안으로 유입되는 것을 확인하였다. 이 펩타이드들 중에서 가장 활성이 좋은 펩타이드는 PLA5였으며 그 활성을 유세포 분석과 형광 현미경분석을 통해서 그 저해 활성을 확인을 하였다. 따라서 PLA5는 염증질환에 있어서 cPLA2α에 대한 억제제로써 국소적인 치료로 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.