Prevotella intermedia ATCC 25611과 Prevotella intermedia ATCC 49046 균주-특이 동정법 개발

Abstract

본 연구에서는 Prevotella intermedia를 균주 수준에서 검출 및 동정할 수 있는 P. intermedia ATCC 49046에 대한 잠재적 균주-특이적 DNA 프로브인 Pig3, 그리고 P. intermedia ATCC 25611^(T)에 대한 잠재적 균주-특이적 DNA 프로브인 Pi29-L과 Pi34의 효용성을 평가하기 위하여, 이들 DNA 프로브들의 핵산 염기서열을 결정하고, 한국인의 구강 내에서 분리 및 검출된 P. intermedia와 P. nigrescens 임상분류 균주의 genomic DNA를 추출하여 Hind Ⅲ 또는 Pst Ⅰ 제한효소로 절단한 다음 Southern blot analysis로 균주-특이적 여부를 검증하였다. 그리고 프로브들의 핵산 염기서열을 결정하고, 균주를 동정할 수 있는 균주-특이적 PCR 프라이머를 설계 및 제작하여 PCR법을 시행하였다. Pig3 DNA 프로브는 1,074bp의 핵산 염기서열로 구성되어 있고, Hind Ⅲ 및 Pst Ⅰ 제한효소를 이용하여 표준균주와 한국인에서 분리한 임상균주의 Southern blot analysis 결과에서 P. intermedia ATCC 49046인 참고균주에서만 양성반응을 보였다. 그리고 균주-특이적 PCR 프라이머를 설계 및 제작하여 PCR법을 시행한 결과에서도 P. intermedia ATCC 49046인 참고균주에서만 밴드가 보였다. Pi29 및 Pi34 DNA 프로브는 1,787bp 및 2,146bp의 핵산 염기서열로 구성되어 있고, Hind Ⅲ 및 Pst Ⅰ 제한효소를 이용하여 표준균주와 한국인에서 분리한 임상균주의 Southern blot analysis 결과에서 P. intermedia ATCC 25611^(T)인 표준균주에서만 양성반응을 보였다. 그리고 균주-특이적 PCR 프라이머를 설계 및 제작하여 PCR법을 시행한 결과에서도 P. intermedia ATCC 25611^(T)인 표준균주에서만 밴드가 보였다. 이상의 결과를 종합할 때, Pig3, Pi29 및 Pi34 DNA 프로브들은 P. intermedia ATCC 25611^(T) 및 P. intermedia ATCC 49046을 균주 수준에서 신속하게 검출 및 동정할 수 있어 이들 균주들의 보존적 측면에서 유용하게 이용가능하리라 생각된다.|The objective of this study was to evaluate the strain-specificity of a DNA probe, Pig3, for Prevotella intermedia ATCC 49046 (G8-9K-3) and two DNA probes (Pi29-L and Pi34) for P. intermedia ATCC 25611^(T) and to develop the sets of strain-specific polymerase chain reaction (PCR) primers. The purpose of this study is to evaluate the specificity of the DNA probes with type strains, reference strains and clinical strains of P. intermedia isolated from Koreans. This study procedure included 1) whole-genomic DNA extraction of strains, 2) confirmation of species-specific DNA probe by Southern blot analysis, 3) determination of nucleotide sequences of species-specific DNA probe, 4) design of PCR primers and 5) PCR. Southern blot hybridization was identified that the three DNA probes only reacted with the Hind Ⅲ- or Pst Ⅰ-digested genomic DNA of P. intermedia ATCC 49046 or P. intermedia ATCC 25611^(T). The data showed that the DNA probes, Pig3 (1,074 bp), Pi29 (1,787 bp) and Pi34 (2,146 bp) reacted with Hind Ⅲ-digested genomic DNAs from the strains used in this study. The results of PCR were showed that the PCR primers, based the nucleotide sequences of three DNA probes, could produce the strain-specific amplicons from P. intermedia ATCC 49046 or P. intermedia ATCC 25611^(T). The results suggest that the three DNA probes and the PCR primers could be useful for the identification of P. intermedia ATCC 49046 or P. intermedia ATCC 25611^(T), especially in ascertaining the authenticity of the strain.