Enterobacter cowanii 6L로부터 유자정유 대사능 유전자의 분리 및 그 형질전환주에 의한 유자정유 생전환

Abstract

(+)-Limonene을 가한 집적배양에 의하여 유자껍질로부터 유자정유성분 대사능을 지닌 미생물(6L)을 분리하였다. 16S rDNA sequencing을 통하여 이 분리 균주는 E. cowanii 로 동정 되었으며, E. cowanii 6L이라고 명명하였다. E. cowanii 6L로부터 유자정유성분 대사능을 지닌 유전자를 분리하였다. 3종의 유전자가 각각 전혀 다르며, 모균주 E. cowanii 6L로부터 유래한 유전자임을 확인하였고 각각의 유전자를 pREC3, pREC4, pREC6라 명명하였다. 3종의 유전자를 숙주균인 E. coli TG1에 형질전환하였고 각각을 EC3, EC4, EC6라고 명명하였다. pREC3은 총 8,585개의 염기로 이루어졌으며, 4개의 open reading frame이 존재하였다. pREC4는 총 4,641개의 염기로 이루어졌으며, 3개의 open reading frame이 존재하였다. pREC6는 총 7,719개의 염기로 이루어졌으며, 2개의 open reading frame이 존재하였다. NCBI database를 통하여 각각의 유전자의 상동성 분석을 시행하였다. B. stearothermophilus BR388로부터 분리된 limonene hydroxylase 유전자와 ORF3-2 유전자는 34%, ORF4-1 유전자는 45.7%, ORF6-1 유전자는 47%, ORF6-2 유전자는 45%의 상동성을 보였다. 형질전환주 EC3, EC4, EC6는 유자정유성분을 유일한 탄소원으로 이용하여 주요 대사산물로 linalool, terpinen-4-ol, α-terpineol을 공통적으로 생산하였다. 각각의 형질전환주는 그 밖에 소량의 각기 다른 향기물질을 생산하였는데 이 물질들에 의해 각각의 배양액에서 전혀 다른 향이 났음을 알 수 있었다. 형질전환주의 유자정유성분 대사능 시스템 안정화를 위하여 각각의 형질전환주를 공동배양(EC3+EC4, EC3+EC6, EC4+EC6, EC3+EC4+EC6) 하였다. M9 액체최소 배지에서 유일한 탄소원으로 유자정유성분을 공급하여 28℃에서 배양하였다. 4종의 공동배양액 모두 단독배양에서보다 약 12-23배 높은 균 생육도를 보였다. 공동배양액의 주요한 대사산물로는 linalool, terpinen-4-ol 및 α-terpineol이였으며, 각각의 공동배양액에 따라 소량의 각기 다른 향기물질을 생산하였는데 이 물질들이 각각의 배양액 전체향에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 유자정유 대사능을 지닌 유전자의 강력한 단백질 발현을 위하여 pET29b(+) vector를 이용하여 고발현을 시도하였다. M9 액체최소 배지에서 유일한 탄소원으로 유자정유성분을 공급하여 28℃에서 배양하였다. 고발현 배양액의 주요한 대사산물로는 linalool, terpinen-4-ol 및 α-terpineol이였으며, 각각의 고발현 배양액은 소량의 각기 다른 향기물질을 생산하였는데 이 물질들이 각각의 배양액 전체향에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. E. cowanii 6L로부터 유자정유성분 대사능을 지닌 유전자 ORF3-2(920bp), ORF4-1(1,515bp), ORF6-1(1,776bp), ORF6-2(1,356bp)를 분리하여 염기서열을 규명하였다. ORF3-2 유전자는 306개의 아미노산으로 이루어진 limonene hydroxylase 유전자였다. ORF3-2 유전자를 지닌 형질전환주로부터 분리해낸 효소액으로 limonene hydroxylation능 확인을 위한 반응액에서 주요한 물질로 linalool, dihydrolinalool을 생산하였다. ORF4-1 유전자는 505개의 아미노산으로 이루어진 limonene hydroxylase 유전자였다. ORF4-1 유전자를 지닌 형질전환주로부터 분리해낸 효소액으로 limonene hydroxylation능 확인을 위한 반응액에서 주요한 물질로 linalool, dihydrolinalool을 생산하였다. ORF6-1 유전자는 592개의 아미노산으로 이루어진 limonene hydroxylase 유전자였다. ORF6-1 유전자를 지닌 형질전환주로부터 분리해낸 효소액으로 limonene hydroxylation능 확인을 위한 반응액에서 주요한 물질로 perillyl alcohol, linalool 및 dihydrolinalool을 생산하였다. ORF6-2 유전자는 452개의 아미노산으로 이루어진 limonene hydroxylase 유전자였다. ORF6-2 유전자를 지닌 형질전환주로부터 분리해낸 효소액으로 limonene hydroxylation능 확인을 위한 반응액에서 주요한 물질로 perillyl alcohol, α-terpineol, linalool 및 dihydrolinalool을 생산하였다.|Citron essential oil was extracted from citron(Citrus junos) fruit by steam distillation. E. cowanii 6L was isolated from citron peel by using an enrichment culture containing (+)-limonene. It was identified by 16S rDNA sequencing. The pREC3, pREC4 and pREC6 from E. cowanii 6L encoding citron essential oil degrading pathway gene were cloned. The cloned pREC3, pREC4 and pREC6 were expressed into E. coli EC3, EC4 and EC6, respectively. The pREC3 gene consisted of a 8,585bp, revealing 4 open reading frames. The pREC4 gene consisted of a 4,641bp, revealing 3 open reading frames. The pREC6 gene consisted of a 7,719bp, revealing 2 open reading frames. The amino acid sequence deduced from the E. cowanii 6L was compared with those of other genes in NCBI database. Limonene hydroxylase gene(1,632bp) from B. stearothermophilus BR388 showed 34% identity with the ORF3-2 gene, 45.7% identity with the ORF4-1 gene, 47% identity with the ORF6-1 gene and 45% identity with the ORF6-2 gene. E. coli transformants EC3, EC4, and EC6 produced linalool, terpinen-4-ol and α-terpineol as major bioconverted products, and several minor compounds. The aroma compounds from the E. coli transformants were different from the minor compounds. E. coli transformants EC3, EC4 and EC6 had more stable citron essential oil metabolic systems than did E. cowanii 6L. E. coli transformants EC3, EC4 and EC6 harboring citron essential oil degrading pathway genes were co-cultured in M9 minimal media with citron essential oil as a sole carbon source at 28℃. Each co-culture(EC3+EC4, EC3+EC6, EC4+EC6 and EC3+EC4+EC6) showed 12-13 times higher cell growth than each single culture. Microbial conversion products from the co-culture were determined by GC-MS. Linalool, terpinen-4-ol and α-terpineol were found to be major common products from co-culture. Various minor products also were detected and seemed to be important in flavor characteristics of cultures. The cloned genes were overexpressed in pET29b(+) vector and E. coli BL21(DE3) system. E. coli transformant harvoring citron essential oil degrading pathway gene was cultured in M9 minimal media with citron essential oil as a sole carbon source at 28℃. Microbial conversion products from the overexpressed culture were determined by GC-MS. Linalool, terpinen-4-ol and α-terpineol were identified as the major microbial conversion products of citron essential oil. Various minor products were also detected and seemed to be important in flavor characteristics of cultures. ORF3-2 gene(920bp), ORF4-1 gene(1,515bp), ORF6-1 gene(1,776bp) and ORF6-2 gene(1,356bp) from E. cowanii 6L which can degrade citron essential oil has been cloned and sequenced. ORF3-2 gene contained a single open reading frame encoding a single subunit limonene hydroxylase gene composed of 306 amino acid residues. Crude enzyme from E. coli TG1 harboring ORF3-2 was reacted with limonene. The major reaction products were identified as linalool and dihydrolinalool. ORF4-1 gene contained a single open reading frame encoding a single subunit limonene hydroxylase gene composed of 505 amino acid residues. Crude enzyme from E. coli TG1 harboring ORF4-1 was reacted with limonene. The major reaction products were identified as linalool and dihydrolinalool. ORF6-1 gene contained a single open reading frame encoding a single subunit limonene hydroxylase gene composed of 592 amino acid residues. Crude enzyme from E. coli TG1 harboring ORF6-1 was reacted with limonene. Major reaction products were identified as perillyl alcohol, linalool and dihydrolinalool. ORF6-2 gene contained a single open reading frame encoding a single subunit limonene hydroxylase gene composed of 452 amino acid residues. Crude enzyme from E. coli TG1 harboring ORF6-2 was reacted with (+)-limonene. The major reaction products were identified as perillyl alcohol, α-terpineol, linalool and dihydrolinalool.