구강 전암병소와 편평세포암종에서 L-type Amino Acid Transporter 1 (LAT1) 과 4F2 Heavy Chain (4F2hc)의 발현

Abstract

Ⅰ. 서론 종양세포는 지속적인 성장을 위해 에너지를 유기 영양분을 이용한다는 것은 잘 알려져 있다. 여러 연구 결과 단백질 생합성을 지원하기 위해 종양세포의 증식과정 동안 아미노산의 요구가 증가한다는 여러 연구 결과가 제시되고 있다 Ⅱ. 연구목적 이 연구에서는 사람의 정상 구강점막, 전암병소와 편평세포암종에서 LAT1과 4F2hc의 발현을 관찰하여 다단계 구강암 발암과정에서 LAT1과 4F2hc의 역할을 살펴보고, 이의 생물학적 표지자로의 효용 가능성을 알아보고자 하였다. Ⅲ. 연구재료 및 방법 A. 연구재료 연구재료로는 조선대학교 치과대학 구강병리학교실에 생검 의뢰된 조직 중에서 정상 구강점막, 전암병소 및 편평세포암종으로 진단된 예들에서 파라핀 보관 상태가 양호한 경우만 선택하였다. 구강 전암병소 (남성 21예, 여성 15 예, 연령분포 20 - 75세) 는 과증식 (n=11), 경도 (n=9), 중등도 (n=9) 와 심도 (n=7) 이형성증을 분석하였다. 발생부위로는 협점막 (n=14), 구강저 (n=9), 혀 (n=8), 구개 (n=3)와 후구치부 (n=2)였다. 구강 편평세포암종은 총 37예 (남성 20, 여성 17예, 연령분포 44 - 82 세)로, 치은 (n=15), 구강저 (n=7), 혀 (n=6), 구개 (n=5)와 후구치부 (n=4)에 분포하였다. 편평세포암종은 분화도에 따라, 분화도 좋음 (n=14), 증등도 (n=13) 와 분화도 나쁨 (n=10)으로 나누었다. 9예의 정상 구강점막 (남성 6, 여성3, 연령분포 16-80세)을 대조군으로 사용하였고, 그 분포는 치은과 치조제 (n=4), 협점막 (n=2), 구개 (n=2)와 혀 (n=1)로 구성되어 있었다. B. 면역조직화학 염색 면역조직화학 염색은 파라핀에 포매된 조직을 5 ㎛로 절편을 만들어 poly Lysine-coated glass 슬라이드에 부착하고 실온에서 밤새 건조하였다. 자일렌과 알콜에 순차적으로 처리하여 탈파라핀화 한 다음 내인성 효소 활성을 억제하기 위해 3% hydrogen peroxide에 15분간 침전하였다. 항원 복구는 autoclave 121.비특이적인 항체 반응을 줄이기 위해 절편을 Tris-Hcl에 수세하고 정상 1% BSA (bovine serum albumin in Tris-Hcl) 에 1시간 배양하였다. Tris-Hcl에 수세한 후, LAT1 (1:100, Kumamoto Immunochemical Laboratory, Transgenic, Kumamoto, Japan)과 4F2hc (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 일차항체를 40C에서 밤새 반응 시켰다. 일차항체 반응 후에, 절편을 Tris-Hcl에 충분히 수세하고 streptavidin-biotin 복합체 (Dako Corp., Carpinteria, CA, USA)에 제조자의 지시에 따라 노출시켰다. 발색제로는 Diaminobenzidine (Dako Corp.)을 이용하였고 Mayer씨 hematoxylin으로 대조염색한 후 검경하였다. Ⅳ. 평가 상피와 종양에서 LAT1과 4F2hc 염색 강도(intensity)는 4군으로 나누어 평가하였다. 0 = no; 1 = mild; 2 = moderate; and 3 = strong staining intensity. 면역 염색의 양(quantity)은 양성 반응의 정도를 상피와 종양에서 0 = no positive immunostaining, 1 = <10%; 2 = 10-25; 3 = 25-50; and 4 = >50% 로 평가하였다. 강도와 양의 합을 구하여 평가하였고, 이는 최대 7 최소 0이다. 그 결과를 평균과 표준오차로 표시하였고 통계학적 유의성은 student's t-test로 검정하였다. P<0.05를 통계학적 유의수준으로 설정하였다. Ⅴ. 연구결과 정상 구강점막, 전암병소 및 편평세포암종에서 세포층과 분화 정도에 따라 LAT1과 4F2hc의 발현은 다양하였지만 조직의 기원 부위와는 관계가 없었다. LAT1. 정상 구강점막에서, LAT1은 기저층에만 국한하여 주로 세포막 주위에 분포하였다. LAT1은 정상에서 과증식, 이형성증을 거쳐 편평세포암종으로 진행하면서 발현이 증가하였다. 특히, 심한 이형성증을 보이는 경우 전층에 고루 발현하였다. 편평세포암종에서는 분화가 매우 잘 된 편평상피와 각질 진주를 제외하고 대부분의 종양세포에 발현하였지만, 주로 종양 섬의 앞선(tumor front) 세포에 강하게 반응하였다. 분화가 나쁜 경우에는 단지 소수의 종양세포에만 양성으로 나타났다. LAT1 발현의 평균치는 정상 (2.78 + 0.28), 과증식 (3.45 + 0.28), 경도 (4.67 + 0.28), 중등도 (5.43 + 0.24)에서 심한 이형성증 (6.29 +0.29)으로 이형성증이 증가할 수록 그 발현이 증가하였다. 발현의 차이는 정상과 경도 이형성증 (p<0.05), 정상과 중등도 이형성증 (p<0.01), 정상과 심도 이형성증 (p<0.001) 모두 통계학적으로 유의하였다. 분화도에 따른 편평세포암종의 LAT1의 발현(mean + S.E.M.)은 분화도 좋음 5.43 + 0.42, 중등도 6.23 + 0.26, 분화도 나쁨 3.30 +0.37으로 분화도가 나쁜 경우가 분화도 좋음과 중등도 분화도에 비해 감소하였다. 4F2hc. 정상 구강점막에서, 4F2hc는 각질층을 포함하여 전체 상피층에 발현하였지만 기저층에는 매우 미약하게 반응하였다. 발현 양상은 세포막과 세포질에 모두 염색되었다. LAT1 발현과 비슷하게, 이형성 정도가 진행함에 따라 그 발현이 증가하였다. 분화가 좋거나 중등도 분화를 보이는 편평세포암종에서, 4F2hc은 종양세포의 세포질과 세포막 그리고 각질 진주에 강하게 반응하였다. 분화가 나쁜 경우는 소수의 종양세포에서만 발현되었다. 4F2hc 발현 평균치는 정상 (3.78 + 0.32), 과증식 (4.90 + 0.49), 경도 (4.90 + 0.35), 중등도 (5.33 + 0.35), 심도 (6.14 + 0.26)로 이형성이 증가함에 따라 그 발현도 증가하였다. 4F2hc 발현의 차이는 정상과 중등도 이형성증 (p<0.05), 정상과 심도 이형성증 (p<0.01)에서 통계학적으로 유의하였다. 그러나 정상과 과증식 및 경도 이형성은 그 차이가 없었다. 분화도에 따른 편평세포암종의 4F2hc의 발현(mean + S.E.M.)은 분화도 좋음, 중등도, 나쁨에 따라 각각 5.36 + 0.30, 5.00 + 0.25 and 3.80 + 0.40로 분화도에 따라 그 발현이 감소하였다. Ⅵ. 결론 아미노산 수송체는 세포에 유기 영양분을 공급하는데 중요한 역할을 한다. 이 연구에서는 사람의 정상 구강점막, 전암병소와 편평세포암종에서 면역조직화학적으로 아미노산 수송계 L의 LAT1과 그 보조인자인 4F2hc의 발현을 관찰하여 다단계 구강암 발암과정에서 LAT1과 4F2hc의 역할을 살펴보고, 생물학적 표지자로의 효용 가능성을 알아보고자 하였다. LAT1과 4F2hc은 정상, 과증식, 이형성증과 편평세포암종으로 진행하면서 그 발현이 증가하였다. 특히, LAT1은 4F2hc의 보조로 종양의 성장을 촉진할 것으로 추정할 수 있다. 아울러 LAT1은 다단계 구강암 발생과정에서 유용한 생물학적 표지자로 이용할 수 있음을 확인하였다. 앞으로, LAT1 특이적인 억제가 구강암 세포의 성장을 억제할 수 있는 새로운 이론적 근거를 제시하였다고 생각한다.|Amino acid transporters play an important role in supplying organic nutrient to cells. The expression of L-type amino acid transporter 1 (LAT1) and its subunit 4F2 heavy chain (4F2hc) was evaluated to determine the alterations to these transporters in oral normal mucosa (ONM), oral precancerous lesion (OPL) and oral squamous cell carcinoma (OSCC). Sections from formalin-fixed, paraffin-embedded samples of ONM, OPL or OSCC were examined using immunohistochemical staining to detect LAT1 and 4F2hc proteins. The LAT1 and 4F2hc expression increased progressively from ONM to hyperplastic and to dysplastic lesions and OSCC. In particular, LAT1 may be a more specific indicator of tumor progression than 4F2hc. The gradually increasing LAT1 and 4F2hc expression detected during the multistep progressive change shows that the protein may have an important role in the early stages of multistep oral carcinogenesis. In addition, the specific inhibition of LAT1 and 4F2hc might be a new rationale to suppress oral cancer progression.