Studies on Structure, Function and Lipid Membrane Interaction of Antimicrobial Model Peptides Containing D/L-Proline or Peptoid Residues

Abstract

양쪽 친매성 α-helix 구조-모델형 항균 펩타이드(α-helical model antimicrobial peptide)인 KLW (KWKKLLKKLLKLLKKLLK-NH2)는 박테리아 세포 및 포유류 세포에 대하여 강한 독성을 나타내는 세포에 선택성이 없는 펩타이드이다. 본 연구에서는 KLW의 소수성 helix face 또는 친수성 helix face에의 L-Pro 또는 D-Pro도입이 구조, 세포특이성 및 막결합 친화성에 미치는 영향을 조사하기 위해 KLW의 소수성 helix face 또는 친수성 helix face에 L-Pro 또는 D-Pro이 치환된 4종류의 펩타이드를 합성하였다. 그 결과 KLW의 소수성 helix face에 위치하는 Leu^(9)에 L-Pro 또는 D-Pro의 치환이 친수성 helix face에 위치하는 Lys^(11)에 L-Pro 또는 D-Pro의 치환보다 용혈활성을 감소시키고 항균활성을 증가시켰다. 아울러 D-Pro를 포함한 펩타이드는 L-Pro를 포함한 펩타이드 보다 용혈활성이 더 감소하였다. Tryptophan 형광 분석을 통하여 KLW-L9P, KLW-L9p와 KLW-K11p의 높은 항균활성 및 낮은 용혈활성은 음전하를 띤 인지질과의 선택적 상호작용에 기인한다는 사실을 알았다. 원편광 이색성(circular dichroism) 분석을 통하여 KLW에의 L-Pro 또는 D-Pro의 치환은 펩타이드의 α-helicity의 감소를 유도하고 L-Pro 치환 보다 D-Pro의 치환이 더욱더 α-helix 구조를 파괴한다는 사실을 알았다. 따라서 이 결과는 세포 선택성이 없는 양쪽 친매성 α-helix 구조 펩타이드의 소수성 helix face에 D-Pro을 치환하면 용혈활성이 없으며, 높은 박테리아 세포 선택성을 갖는 새로운 항균 펩타이드의 설계에 유용하게 이용 될 수 있다는 사실을 알았다. 또한, KLW의 소수성 helix face, 친수성 helix face 또는 이들의 경계면에의 하나 또는 두개의 Ala에 대한 펩토이드(Nala)의 도입이 펩타이드의 구조, 세포 선택성 및 항균작용기작에 미치는 영향에 대해서 조사하였다. 그 결과 KLW의 소수성 helix face에 하나 또는 두개의 Nala 잔기의 치환이 친수성 helix face 또는 경계면에의 치환 보다 높은 박테리아 세포선택성을 유도하였다. 아울러 Tryptophan 형광 연구를 통해서 소수성 helix face에 하나 또는 두개의 Nala 잔기의 치환의 높은 박테리아 세포선택성은 음전하를 띤 인지질(negatively charged phospholipid)과의 선택성 상호작용에 기인한다는 사실을 알았다. 특히 소수성 helix face에 두개의 Nala 잔기의 치환은 음전하를 띤 인지질과 강한 상호작용에도 불구하고 calcein leakage는 현저하게 감소하였으며, 또한 KLW-L9,13-a는 2μM 에서도 지질막을 투과한 후 DNA나 RNA 결합에 의해서 세포기능을 억제하는 펩타이드로 알려진 buforin II과 PR-39과 마찬가지로 intact S. aureus에 대한 membrane potential change을 거의 유도하지 않았다. 이와는 대조적으로 KLW를 비롯한 다른 펩타이드는 0.1μM에서도 현저한 membrane potential change를 유도하였다. 이와 같은 결과는 소수성 helix face에 두개의 Nala 잔기를 치환함으로써 많은 구조 변화가 따르고 그에 따른 flexibility에 의해서 미생물에 대한 살균작용이 세포지질막을 soluble 하거나 pore를 형성함으로써 독성을 나타내는 것이 아니라 지질막에 손상을 주지 않고 penetration 함으로써 세포기능의 억제할 것임을 암시하였다.|A synthetic amphipathic α-helical model peptide, KLW, displays non-cell selective cytotoxicity. To investigate the effects of L- or D-Pro kink incorporation into hydrophobic or hydrophilic helix face of KLW on structure, cell selectivity and membrane binding affinity, we designed its a series of four peptides, in which Leu^(9) and Lys^(11) in the hydrophobic and hydrophilic helix face of KLW, respectively, are substituted with L- or D-Pro. An L- or D-Pro substitution of Leu^(9) at the hydrophobic helix face of KLW induced a more significant reduction in hemolytic activity with improved antibacterial activity than that of Lys^(11) in the hydrophilic helix face. In addition, D-Pro-containing peptides displayed less hemolytic activity than L-Pro-containing peptides. Tryptophan fluorescence studies revealed that bacterial cell selectivity of KLW-L9P, KLW-L9p and KLW-K11p is closely related to selective interactions with negatively charged phospholipids. CD analysis revealed that L- or D-Pro incorporation into KLW reduces the α-helicity of the peptide and D-Pro incorporation induces more significant disruption in α-helical structure than L-Pro incorporation. These results collectively suggest that D-Pro incorporation into the hydrophobic helix face of non-cell selective amphipathic α-helical peptides may be useful for the design of novel antimicrobial peptides possessing high bacterial cell selectivity without hemolytic activity. Also, we investigated the effects of one or two Nala (peptoid residue for Ala) residue incorporation into the hydrophobic face, hydrophobic/hydrophilic interface or hydrophilic face of an α-helical LK-rich antimicrobial peptide, KLW on their secondary structure, cell selectivity and mechanism of antimicrobial action. KLW-L9-a and KLW-L9,13-a with one or two Nala residues at their hydrophobic face showed much higher bacterial cell selectivity than the peptides with one or two Nala residues at their hydrophilic face or hydrophobic/hydrophilic interface. Tryptophan fluorescence studies indicated that the great bacterial cell selectivity of KLW-L9-a and KLW-L9,13-a is mainly due to the selective binding ability for negatively charged phospholipids. Despite a much higher degree of association with negatively charged phospholipids, the calcein leakage of KLW-L9,13-a is significantly decreased for negatively charged phospholipids. In particular, KLW-L9,13-a induced less or no measurable transmembrane potential change to intact S. aureus at the concentration of 2 μM, as observed in buforin II and PR-39 known as a membrane-penetrating peptide. In contrast, the other peptides containing KLW caused a significant potential change at 0.1 μM, as observed in magainin 2 and melittin known as a membrane-disrupting antimicrobial peptide. These results suggested that the killing mechanism of KLW-L9,13-a against the target microbes may be not via the perturbation of the cell membrane but the inhibition of the cellular functions by binding to DNA and/or RNA.