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Structure, Function and Mode of Action of Antimicrobial Peptides, IsCT, Piscidin and Pleurocidin

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Author(s)
林信生
Issued Date
2004
Abstract
양식어류(aquacultured fish)의 조직으로 유래된 α-helix 구조형 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)인 piscidin-1 (Pis-1)은 박테리아에 강한 항균활성을 가지나 포유류 유래 세포에 대하여서도 또한 높은 세포독성을 가지고 있다. 본 연구에서는 Pis-1의 가운데 위치하는 두개의 glycine residue (Gly^(8) 및 Gly^(13)) mutation이 세포 선택성 (cell selectivity) 및 항생작용기작에 미치는 효과를 조사하기 위해서 Gly→Ala 또는 Gly→Pro 치환 유사체를 합성하였다. SDS 마이셀상에서 Pis-1의 3차 구조는 핵자기공명분석법(NMR)에 의하여 Pis-1은 Gly^(13)에 bent 영역을 가지며, Phe² 부터 Gly^(21)까지 양쪽 친매성 α-helical 구조를 나타내었다. Pis-1 PG 는 가장 높은 박테리아 세포 선택성을 나타내었다. Pis-1의 13번째 위치보다는 8번째 위치의 유동성이 펩타이드의 항균활성 및 membrane permeabilization을 향상시키는데 중요한 역할을 한다는 것으로 나타났다.
IsCT는 전갈의 일종인 Opisthacanthus madagascariensis에서 분리된 비세포특이성(non-cell-selectivity)을 나타내는 항균 펩타이드 로서 박테리아 세포 뿐 만 아니라 포유류세포에 대해서도 강한 독성을 나타낸다. 본 연구에서는 IsCT의 구조-활성 상관관계를 조사하기 위하여 여러 종류의 IsCT 유사체를 합성하고, 2차원 핵자기공명 분석법(2D-NMR spectroscopy)에 의하여 이들의 3차 구조를 결정하였다. IsCT는 Gly³ 부터 Phe^(13)까지 직선형 α-helix구조 (linear α-helical structure)를 취하고, IsCT-K는 Leu2 부터 Phe^(13)까지 직선형 α-helix구조를 나타내었다. 펩타이드의 middle site에 bend region을 가지는 IsCT-PK₂는 높은 항균활성을 나타내지만, 용혈활성을 전혀 나타내지 않았다. 이와 같은 사실은 proline residue에 의하여 유도되는 bend structure가 박테리아 세포 선택성(bacterial cell selectivity)을 결정하는데 중요하다는 것을 시사하였다. 또한 내성균주에 대하여서도 높은 항균활성을 나타내는 IsCT-PK₂는 새로운 항생 펩타이드의 개발에 도움이 될 것으로 기대된다. 또한 본 연구에서는 펩토이드 잔기 (peptoid residue)의 도입이 α-구조형 항균 펩타이드의 구조, 세포 선택성 및 작용기작에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, 펩토이드 잔기를 포함한 2종류 항균 펩타이드(IsCT-PK₃-a 와 IsCT-PK₃3-l )를 합성하였다. 펩토이드 잔기를 포함한 이들 항균 펩타이드는 400 μM의 높은 농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않는 반면에 박테리아 세포에 대해 높은 항균활성을 나타내었다. Tryptophan fluorescence분석에서는 IsCT-PK₃-a 와 IsCT-PK₃-l 는 음전하를 띠는 인지질막(negatively charged phospholipid membrane)과 높은 선택적 결합 친화성을 보였다. 아울러 IsCT-PK₃-a 와 IsCT-PK₃-l 는 중성 인지질막(zwitterionic phospholipid membrane) 뿐 만 아니라 음전하를 띠는 인지질막에서도 calcein leakage를 매우 적게 일으켰다. 이런 결과는 이들 펩타이드는 세포막에 pore를 형성하거나, 침투성을 증가시키거나 또는 세포막의 분해에 의해 미생물을 죽이는 기작과는 다르다는 것을 시사하였다.
Pleurocidin (Ple)은 겨울 넙치(winter flounder) 의 피부 점막(skin mucosa)에서 발견된 25개의 잔기를 가지는 α-helix 구조형 항균 펩타이드이다. Ple는 용혈활성을 나타내지 않으며, 높은 박테리아 세포 선택성을 나타낸다. 본 연구에서는 Ple의 13번째 및 17번째에 위치하는 두개의 glycine 잔기가 펩타이드의 구조, 박테리아 세포 선택성 및 모델막과의 상호작용에 미치는 영향을 조사기 위해, Gly→Ala 치환 유사체를 합성하였다. Ple의 13번째 및 17번째의 Ala-치환 은 항균활성에는 중요한 변화를 제공하지 않았으나, 인간의 적혈구세포에 대한 용혈활성을 증가시켰다. 원편광 이색성 (CD)을 통해서 3종류의 Gly→Ala 유사체는 α-helix 함량이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 Ple의 Gly^(13) 부터 Gly^(17)까지 hinge region이 구조적 유동성(structural flexibility) 및 박테리아 세포 선택성을 제공하는 것으로 추측된다. 아울러 tryptophan fluorescence 분석을 통하여 Ple의 박테리아 세포 선택성은 음전하를 띠는 인지질(negatively charged phospholipid)과의 선택적 상호작용과 밀접한 관련성이 있다는 사실을 밝혔다.|Piscidin-1 (Pis-1) is a cationic α-helical antimicrobial peptide isolated from the tissues of an aquacultured fish, hybrid striped bass. Pis-1 shows non-cell-selectivity with strong antibiotic activity against bacterial and mammalian cells. To investigate the effect of the mutation of two glycine residues (Gly^(8) and Gly^(13)) in the middle positions of Pis-1 sequence on their structure, cell selectivity and mode of antimicrobial action, we synthesized several analogues with Gly→Ala and/or Pro substitution. The tertiary structure of Pis-1 in the presence of SDS micelles was determined by using NMR spectroscopy. Pis-1 was found to be an amphipathic α-helical structure from Phe² to Gly^(21) with bent region at Gly^(13). Pis-1 PG showed the highest bacterial cell selectivity. Pis-1 GA, Pis-1 PG and Pis-1 PA with either Gly or Pro at their position 8 showed slightly better biological activities than Pis-1 AG, Pis-1 GP and Pis-1 AP with either Gly or Pro at their position 13, respectively. These results demonstrated that the structural change of the position 8 of Pis-1 plays more important role to enhance antibiotic activity and membrane permeability than that of its position 13.
IsCT that has potent cytolytic activity against both mammalian and bacterial cells is a non-cell-selective antimicrobial peptide isolated from the scorpion Opisthacanthus madagascariensis. To investigate the structure-activity relationships of IsCT, we synthesized several analogues of IsCT and determined their three-dimensional structures in solution by 2D-NMR spectroscopy. IsCT has a linear α-helical structure from Gly³ to Phe^(13), and IsCT-K has a linear α-helical structure from Leu2 to Phe^(13). IsCT-PK₂, which has a bend in its middle region, exhibited the highest antibacterial activity without hemolytic activity, suggesting that the proline-induced bend is an important factor for bacterial cell selectivity. Its potent activity against antibiotic-resistant bacteria suggests that IsCT-PK₂ may serve as a promising lead candidate in the development of new peptide antibiotics. In order to elucidate the effects of the incorporation of peptoid residues into an α-helical antimicrobial peptide on the structure, cell selectivity and mechanism of action, we synthesized peptoid-containing antimicrobial peptides, in which Nala or Nleu is substituted for Pro in the central position of IsCT-derived antimicrobial peptide (ILKKIWKPIKKLF-NH₂). IsCT-PK₃-a and IsCT-PK₃-l showed high antibacterial activity without hemolytic activity at high concentration of 400 μM. Tryptophan fluorescence studies revealed that IsCT-PK₃-a and IsCT-PK₃-l showed high selective binding affinity to negatively charged phospholipid membranes. Furthermore, IsCT-PK₃-a and IsCT-PK₃-l caused less calcein leakage from zwitterionic phospholipid membranes as well as negatively charged phospholipid membranes. These results suggested that the mechanism of bacterial killing of these peptides should be quite different from that of killing microorganisms either by forming pores and increasing the permeability or by disintegrating cell membrane.
Pleurocidin (Ple) is a 25-residue α-helical antimicrobial peptide discovered in the skin mucosa of the winter flounder. Ple shows high bacterial cell selectivity with no hemolytic activity. The effect of two glycine residues in positions 13 and 17 of Ple was investigated by Gly→Ala substitution in terms of structure, bacterial cell selectivity and interaction with model membranes. Ala-substitutions in positions 13 and 17 of Ple did not induce a significant change in antibacterial activity, but increased the hemolytic activity against human erythrocytes. CD analysis showed that three Gly→Ala analogues induce a remarkable increase in their α-helical content. These results suggested that the hinge region from Gly^(13) to Gly^(17) of Ple is assumed to provide its conformational flexibility and bacterial cell selectivity. Tryptophan fluorescence study revealed that the bacterial cell selectivity of Ple is closely correlated with its highly selective interaction with negatively charged phospholipids.
Alternative Title
항균 펩타이드 IsCT, piscidin 및 pleurocidin의 구조,기능 및 작용기작에 관한 연구
Alternative Author(s)
Lim, Shin Saeng
Affiliation
朝鮮大學校 大學院
Department
일반대학원 생물신소재학과
Advisor
申松曄
Awarded Date
2005-02
Table Of Contents
TABLE OF CONTENTS
TABLE OF CONTENTS = Ⅰ
LIST OF TABLES = Ⅳ
LIST OF FIGURES = Ⅵ
ABSTRACT = 1
Part Ⅰ: Influence of Glycine Residue Mutation on the Structure and Function of Fish-derived Antimicrobial Peptide Piscidin = 4
Ⅰ. Introduction = 4
Ⅱ. Materials and methods = 6
Ⅱ-1. Peptide synthesis = 6
Ⅱ-2. Bacterial strains = 6
Ⅱ-3. Antimicrobial activity = 6
Ⅱ-4. Hemolysis = 7
Ⅱ-5. Circular dichroism (CD) measurements = 7
Ⅱ-6. Vesicle preparation = 8
Ⅱ-7. Tryptophan fluorescence blue shift = 9
Ⅱ-8. Tryptophan fluorescence quenching = 9
Ⅱ-9. Calcein leakage assay = 10
Ⅱ-10. Transmembrane potential depolarization assay with intact S. aureus cells = 10
Ⅲ. Results = 12
Ⅲ-1. Antimicrobial and Hemolytic Activity of the Peptides = 12
Ⅲ-2. Peptide-induced permeability of lipid vesicles = 12
Ⅲ-3. Secondary structure of the peptides = 13
Ⅲ-4. Tertiary structure of Pis-1 = 14
Ⅲ-5. Tryptophan fluorescence blue shift = 14
Ⅲ-6. Tryptophan fluorescence quenching = 15
Ⅳ. Discussion = 25
Ⅴ. References = 27
Part Ⅱ: Antibiotic Activity and Structural Analysis of the Scorpion-derived Antimicrobial peptide IsCT and Its Analogues = 30
Ⅰ. Introduction = 30
Ⅱ. Results = 32
Ⅱ-1. Peptide design = 32
Ⅱ-2. Antibacterial and hemolytic activities = 32
Ⅱ-3. Tryptophan fluorescence = 33
Ⅱ-4. Three dimensional structures = 33
Ⅲ. Discussion = 42
Ⅳ. References = 44
Part Ⅲ: Bacterial cell selectivity and mechanism of action of IsCT-derived α-helical antimicrobial peptides containing peptoid residue = 47
Ⅰ. Introduction = 47
Ⅱ. Results = 49
Ⅱ-1. Antimicrobial and hemolytic activities. = 49
Ⅱ-2. CD spectrometry = 49
Ⅱ.3. Tryptophan fluorescence blue shift = 50
Ⅱ.4. Tryptophan fluorescence quenching = 50
Ⅱ.5. Peptide-Induced Calcein Leakage from Vesicles = 51
Ⅱ.6. Membrane permeability against intact bacterial cells = 51
Ⅲ. Discussion = 65
Ⅳ. References = 68
Part Ⅳ: Effects of two glycine residues in positions 13 and 17 of pleurocidin on structure, cell selectivity and interaction with model membranes = 70
Ⅰ. Introduction = 70
Ⅱ. Results and discussion = 72
Ⅲ. References = 81
국문요약 = 84
Degree
Master
Publisher
朝鮮大學校 大學院
Citation
林信生. (2004). Structure, Function and Mode of Action of Antimicrobial Peptides, IsCT, Piscidin and Pleurocidin.
Type
Dissertation
URI
https://oak.chosun.ac.kr/handle/2020.oak/5594
Appears in Collections:
General Graduate School > 3. Theses(Master)
Authorize & License
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  • Embargo2005-10-13
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