RNA interference(RNAi)를 이용한 혈관 내막 증식 억제에 관한 유전자 치료 효과

Abstract

(서론 및 목적) : 혈관 치료 방법 중 대복제 정맥을 이용한 말초동맥 우회로술이 지속성이나 안정성, 개존율 면에서 각광 받고 있다. 이러한 결과에도 불구하고 이식 정맥편의 실패는 여러가지 원인에 의해 발생되고 이에 따른 유병율과 사망률에 영향을 끼치며 치료에 많은 비용이 소모되고 있다. 이런 동맥 재협착의 형성 과정에서 내피세포의 손상과 여러 종류의 cytokine이 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 내막증식에 관계되는 대표적인 cytokine으로서는 IL-1, IL-6, PDGF, b-FGF, endothelin등과 세포내 단백질로는 NF-κB, AP-1, E2F등이 있다. 최근에 인체의 혈관 세포에 유전자 물질을 옮기는 방법이 개발 되면서 혈관 질환의 치료에 새로운 방향을 제시해주고 있는데 이에, 본 연구에서는 유전자 치료의 일환으로써 anticytokine Ab, decoy와 더불어 최근 각광 받고 있는 RNAi를 이용, 선택적으로 NF-κB 발현을 억제하여 내막증식의 억제 효과를 실험을 통해 알아 보고자 한다. (방법) : 실험을 대조군과 4개의 실험군으로 나누어 실시하였다. 좌측 장골동맥 내피세포의 손상을 유발하고 Lenti virus만 손상 부위에 1시간 동안 충만 시킨 군을 대조군(3마리), 내피세포의 손상을 유발하고 그 부위 혈관안에 각각 50ug, 200ug의 NF-κB RNAi을 포함한 Lentivirus를 1시간 동안 충만 시킨 군을 각각 6마리 씩 실험군으로 설정 하였으며 또한 각각의 실험군에서 술 후 3일째와 7일째 손상시킨 혈관을 채취하여 면역 염색, 내막-중막 두께 비율, western blotting등으로 결과를 판정 하였다. (결과) : 면역 염색 상에서 대조군과 달리 실험군 모두에서 NF-κB가 RNAi에 의해 억제되었음을 확인 할 수 있었다. 또한 대조군에서, 내막-중막 두께비율은 측정시97±29%를 보였고, western blotting 발현을 100%으로 임의로 설정하여 실험군과 비교 분석키로 하였다. 50ug(3일)그룹은 32±12%의 두께비율과 58%의 western blotting 발현, 50ug(7일)은 41±9% 의 두께비율과 65% western blotting 발현, 200ug(3일)그룹은 30±3%의 두께비율과 30%의 western blotting 발현을, 200ug(7일)그룹은 24±5%의 두께비율과 50%의 western blotting 발현을 보였다. 결과적으로 면역 염색, western blotting 발현과 내막-중막 두께비율로 NF-κB RNAi에 의해 내막 증식 억제가 됨을 확인 할 수 있었다.|Purpose: Vascular injury and inflammation are associated with a number of cytokines which transduce signals through multiple pathways to act as smooth muscle cell (SMC) mitogens. Activation of the nuclear factor?kappa B (NF-[kappa]B) transcription factor is essential for SMC proliferation and is activated by vascular injury in vivo. The purpose of this study is to determine whether knock-down expression mediated by NF-kB RNAi using Lentiviral vector could inhibit the development of intimal hyperplasia & SMC proliferation. Methods: A rat iliac injury model was used to study prevention of intimal hyperplasia. Arteries were assayed at 3rd day & 7th day after injury and infection with shLenti1.1/NF-Bⓐ having NFkB interfering target sequences of AACGATGTTGAGTACCAGTGT. SMCs infected with NFκB RNAi were measured by immunostaining (primary antibody(NF-kB, 1:100, Chemicon). Protein level of NFκB was determined by Western blot assay. Proliferation was measured by I-M ratio. Results: Infection with NF-κB RNAi significantly suppressed in vivo SMCs proliferation & intimal thickening. Inhibition of proliferation was associated with decreased NFκB levels. Conclusions: Suppression of NF-κB inhibited the development of intimal hyperplasia and SMC proliferation in vivo, and may be a future therapeutic option in treatment of vascular diseases.