L-arginine 유발성 급성 신독성에 대한 녹차 polyphenol의 예방 효과

Abstract

배경 : Nitric oxide (NO)는 혈관 평활근을 이완시키는 endothelium-derived relaxing factor (EDRF)로서 처음 보고되었고 그 기능은 국소 신경 전달 물질로서의 역할을 담당하며, 혈소판의 응집과 부착을 억제하고, 대식 세포의 항염증 작용이나 항암 작용 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 녹차의 주요 성분으로 epigallocatechin-3-gallate (EGCG), epigallocatechin, epicatechin-3-gallate, epicatechin, gallocatechin 그리고 catechin 등으로 구성되어 있다. 그 중에서 EGCG는 강력한 항산화 물질로 알려져 있었으나 그 정확한 기전은 아직까지 밝혀져 있지 않고 있다. 본 연구에서는 L-arginine를 투여한 인간 메산지움 세포와 쥐에서 급성 신독성에 대한 녹차 polyphenol의 예방효과를 관찰하며 그 기전을 밝히고자 하였다. 방법 : 인간메산지움 세포에 대한 실험군을 4군으로 나뉘었는데 대조군(A군)은 L-arginine을 투여하지 않은 상태로 배양한 군이며 L-arginine 투여군(B군)은 L-arginine 100 μmol/L 에서 20%씩 serial dilution 했다. iNOS inhibitor 투여군(C군)은 L-arginine 과 iNOS inhibitor (L-NAME, N-nitro-L-arginine-methylester, Sigma, 3, 4, 5, 6, 7, 8 μmol/L)을 투여하였다. Green tea polyphenol 투여군은 L-arginine 과 green tea polyphenol 0.1 g (10, 20, 30 uL)을 10mL PBS에 녹인 후 배지에 투여하였다. 각각의 세포들은 48시간 배양한 후 MTT (3-(4,4-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 실시하였다. 본 실험을 위해 준비된 mice를 4군으로 분류하였는데 1군 (n=5)은 대조군으로 생리식염수를 복강에 투여하였고, 2군 (n=5)은 L-arginine 50 μmol를 복강내 3차례 4일 간격으로 투여한 군이며, 3군 (n=5)은 L-arginine 50 μmol을 2군과 같은 방법으로 투여한 후 iNOS inhibitor (L-NAME, N-nitro-L-arginine-methylester, Sigma)을 12μmol/L을 복강내로 3회에 거쳐 투여하였다. 4군 (n=5)은 L-arginine 50 μmol을 2,3군과 동일한 방법으로 투여한 후 green tea polyphenol은 100mg/Kg을 3회에 거쳐 4일 간격으로 등을 이용한 피하주사를 통해 투여하였다. 각각의 표본에서 iNOS에 대한 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)과 western blot 분석을 실시하고 NO양을 측정(StressXpressTM Hsp60 ELISA kit)하였다. Mice 신장에 대해서는 병리조직학적 검사를 실시하였다. 결과 : 인간메산지움 세포 증식에 대해 L-arginine 100 ⅴ?ol/L를 투여 후 4:1 비율로 희석하여 배양한 결과 메산지움 세포의 증식이 L-arginine의 농도에 비례해서 억제됨을 보여주었다. 특히, 51 ⅴ?ol/L 투여시 급격히 의의있게 증식이 억제되고 (p<0.05), 그 이상을 투여할 때는 많은 차이를 보이지 않았다. L-arginine에 증식이 억제되었던 군에서 green tea polyphenol을 투여 후 의의있게 세포증식이 증가함을 보여주었다 (p<0.05). iNOS RT-PCR과 western blot 결과 iNOS 분획이 L-arginine 투여군에서 증가하였고 iNOS inhibitor 투여군에서는 감소하였으나 green tea polyphenol 투여군에서 의의있는 감소를 보이지 않았다 (p>0.05). 인간 메산지움 세포 배양에서 NO 측정시 대조군 (0.047±0.026)에 비하여 L-arginine 투여군 (0.139±0.047)에서 의의있게 증가하였고 (p<0.01) green tea polyphenol 투여군 (0.052±0.032)에서 의의있게 감소함을 보여주었다 (p<0.01). Mice에서 iNOS RT-PCR 과 western blot 분석 결과 iNOS 분획이 L-arginine 투여군에서는 증가하고 L-NAME 투여군에서는 감소하였으나 green tea polyphenol 투여군에서 의의있는 감소를 보이지 않았다. 신장조직 검사상 L-arginine 투여군에서 사구체는 큰 변화는 없었으며 근위세뇨관 부위에서 경미한 부종과 괴사 소견이 관찰되었으며 green tea polyphenol 투여군과 iNOS inhibitor 투여군에서는 사구체와 세뇨관에서 특별한 소견은 관찰되지 않았다. 결론 : 본 연구에 의하면 과도한 arginine 투여는 iNOS 효소를 통해 NO를 생산하고 신장에서 산소족 scavenging 효소를 감소시켜 인간 메산지움 세포의 증식을 억제하고 mice 신장에서 신부전의 손상을 일으킴을 관찰하였다. 그러나 green tea polyphenol은 arginine으로 유발된 메산지움 세포의 증식 억제를 회복시켜 주고 급성 신독성의 mice에서 신손상에 대한 보호 효과가 있음을 보여주었으며 그 기전은 NO scavenging effect 임을 확인하였다. 그러므로 green tea polyphenol은 신부전을 포함한 신장 질환의 새로운 치료적 접근으로 매우 유용할 것으로 생각된다.|Purpose Green tea polyphenol, (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (EGCG), has potent antioxidants. The aims of this study were to investigate the antioxidative effects of green tea polyphenol on human mesangial cells and mice with L- arginine induced renal toxicity. Method Human mesangial cells were cultured on DMEM (Dulbecco’s minimun essential medium) with L-arginine, iNOS inhibitor (L-NAME, N-nitro-L-arginine-methylester, Sigma) and green tea polyphenol, respectively. The cell proliferation was determined by MTT assay. The iNOS mRNA were determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot. The NO (nitrate and nitrite) level measured by NO ELISA kit (StressXpress^(TM) Hsp60 ELISA kit). The mice (n=20) were divided into 4 groups (n=5/group); group 1 (control group) mice were intraperitoneal (IP) injected 0.9% saline 3 times at 4 day intervals, group 2 (L-arginine group) mice were IP injected L-arginine 50 μmol/L 3 times at 4 day intervals, group 3 (iNOS group) mice were IP injected L- arginine and L-NAME 12 mmol/L 3 times at 4 day intervals, group 4 (polyphenol group) mice were IP injected L-arginine and subcutaneous (sc) injected green tea polyphenol 100mg/Kg 3 times at 4 day intervals. The iNOS mRNA and NO were measured by same methods. The histologic examination were performed after 3days. Results The L-arginine significantly inhibited the proliferation of human mesangial cells in concentration-dependent manner compared with that of control group when the concentration of L-arginine in the media was higher than 51umol/L (p<0.05). The NO level were significantly increased in mesangial cell with L-arginine than control group (0.139±0.047 vs 0.047±0.026, p<0.01) but significantly decreased in green tea polyphenol group than L-arginine group (0.052±0.032 vs 0.139±0.047, p<0.01). In the iNOS RT-PCR and western blot, iNOS fragments were increased in L-arginine group and decreased in iNOS inhibitor group but significantly not decreased in green tea polyphenol group (p>0.05). In the mice with L-arginine injected group (group 2, n=5), iNOS fragments of RT-PCR and western blot were increased than control group (group 1, n=5). In the green tea polyphenol group (group 4, n=5), iNOS fragments of RT-PCR and western blot were not decreased than control group (p>0.05). In the histologic examination, there are proximal tubular necrosis and mild interstitial inflammation in the kidney of mice after L-arginine injection group but no significant pathologic change in green tea polyphenol and L-NAME injected group. It implyed that the biological defence mechanism of green tea polyphenol is free radical scavenging rather than iNOS inhibition. Conclusion The excessive L-arginine developed renal injury by increasing the production of NO and iNOS. The antioxidative effects of green tea polyphenol were pontent in mesangial cell and mice with L-arginine induced renal failure by decreasing NO product with NO scavenging effect. Therefore green tea polyphenol would showed a potent protective effect against the renal disorder.