Regulation of Dictyostelium Development by RapC and Functional Changes of Ras Proteins by the C-terminus of RapC

Abstract

Ras proteins are small GTPases that act as molecular switches in various cellular processes. There are three Rap proteins in Dictyostelium: RapA, RapB, and RapC. Rap proteins are key regulators in cell adhesion and cytoskeleton rearrangement. RapC has a unique function in regulating multicellular development. When Dictyostelium cells are starved, they secrete cAMP, a chemoattractant, and form multicellular mound through aggregation. The aggregates undergo differentiation processes and finally form spores. During this process, wild-type cells form single tip that forms one fruiting body from one multicellular mound. Whereas cells lacking RapC form multiple tips from one multicellular mound. While I investigate the mechanism by which RapC regulates the developmental process of Dictyostelium, I found that multi-tips were formed when wild-type cells were treated with caffeine. Caffeine is an antagonist of adenosine receptor and affects the cAMP signaling pathway in Dictyostelium. Therefore, I investigated the mechanism for the regulation of developmental process by RapC based on the caffeine-mediated cAMP signaling pathway. First, I examined the development of wild-type cells in the presence of caffeine. As expected, wild-type KAx3 cells formed some multi-tips similar to rapC null cells in the presence of 2 mM caffeine. No developmental progress was observed above 3 mM caffeine. Since PI3K and mTORC2 are at the center of the caffeine-mediated cAMP signaling pathway, next. I checked the effects of Torin2 and LY294002 on multicellular development, which are inhibitors of mTORC2 and PI3K, respectively. In wild-type cells, some multi-tips were formed at 1 μM Torin2, whereas a single tip was formed at 30 μM LY294002. These results suggest that the TOR signaling pathway is involved in multi-tip formation process. The TOR complex consists of TOR1 and TOR2. To determine which TOR complex affects the developmental process, I examined the multicellular development of the cells in the presence of 50 nM rapamycin, a mTORC1 inhibitor. Wild-type cells formed some multi-tips at 50 nM rapamycin, indicating that TOR complex1 plays an important role in the developmental process, especially at the tip forming stage of the development. These results suggest that RapC is involved in Dictyostelium development through regulation TOR complex pathway. In Dictyostelium, RapA and RapC have been reported to have opposite functions in cell adhesion and cell migration. RapC has a longer amino acid tail than RapA at the C-terminus. When the C-terminus of RapC was fused to the end of RapA, the function of RapA was reversed. The recombinant RapA-CT had the same function as RapC in cell adhesion and cell migration. In the presence study, to determine whether the C-terminus of RapC can reverse the functions of other Ras proteins, I fused the C-terminus of RapC to the end of RasG, which has the most similar function to RapA among Ras proteins. RasG fused with C-terminus of RapC (RasG-CT) was expressed in rapC null cells and rasG null cells, and the phenotypes were compared those of wild-type cells. rapC null cells expressing RasG-CT showed spread morphology and increased adhesion than wild-type cells. During development, rapC null cells expressing RasG-CT formed multi-tips. The migration speed in chemotaxis was significantly reduced compared to wild-type cells. These results were identical to the phenotypes of rapC null cells. This suggests that the Cterminus of RapC is unable to reverse the functions of RasG. On the other hand, rasG null cells showed increased cell size and decreased adhesion compared to wild-type cells. During development, rasG null cells formed small spores than wild-types cells. rasG null cells expressing RasG-CT were similar to wild-type cells in cell size, adhesion and developmental process. In random cell migration, rasG null cells showed higher migration speed than wild-type cells, but rasG null cells expressing RasG-CT displayed the migration speed similar to wild-type cells. In electrotaxis, rasG null cells showed increased migration speed and decreased directionality than wild-type cells. These phenotypes of rasG null cells were restored by expression of RasG-CT. These results suggest that the C-terminus of RapC is able to reverse the functions of the Rap proteins, but not other Ras proteins.|Ras 단백질들은 다양한 세포 과정에서 분자적 스위치 역할을 하는 작은 GTPases이다. 딕티오스텔리움 내에는 RapA, RapB, 그리고 RapC의 3가지 Rap 단백질이 존재한다. Rap 단백질들은 세포 부착과 세포골격 재배열의 주요 조절자이다. 이전의 연구에서, RapC는 세포의 발달과정을 조절하는데 독특한 기능을 하는 것으로 알려졌다. 딕티오스텔리움 세포는 기아 상태가 되면 화학유인물질인 cAMP 를 분비하고 응집을 통해 다세포 마운드를 형성한다. 응집체들은 분화과정을 거쳐 최종적으로 포자를 형성한다. 이 과정동안, 야생형 세포는 1개의 다세포 마운드에서 1개의 자실체를 형성하는 단일 팁을 형성한다. 반면, RapC 가 결여된 세포는 1 개의 다세포 마운드에서 여러 개의 팁을 형성한다. RapC 가 딕티오스텔리움 발달과정을 조절하는 메커니즘을 조사하던 중, 야생형 세포에 카페인을 처리하면 다중 팁이 형성된다는 사실을 알게 되었다. 카페인은 아데노신의 수용체의 길항제이며, 딕티오스텔리움 내 cAMP 신호전달 경로에 영향을 미친다. 따라서 카페인 매개 cAMP 신호전달 경로를 기반으로 하여 RapC에 의한 발달과정 조절 메커니즘에 대한 연구하였다. 가장 먼저, 카페인의 존재 하에 야생형 세포의 발달과정을 조사하였다. 예상대로, 야생형 KAx3세포는 2 mM 카페인의 존재 하에서 rapC null 세포와 유사한 다중 팁을 일부 형성하였다. 3 mM 이상의 카페인 농도에서는 발달의 진행이 관찰되지 않았다. 카페인 매개 cAMP 신호전달 경로의 중심에는 PI3K 와 mTORC2 가 존재하기 때문에, 다음으로 각각 mTORC2 및 PI3K 억제제인 Torin2 와 LY294002 가 다세포 발달과정에 미치는 영향을 확인하였다. 야생형 세포는 1 μM Torin2에서는 일부 다중 팁을 형성한 반면, 30 μM LY294002 에서는 단일 팁을 형성하였다. 이러한 결과들은 TOR 신호 전달 경로가 다중 팁 형성 과정에 관여한다는 것을 시사한다. TOR 복합체는 TOR1 과 TOR2 로 구성된다. 어떤 TOR 복합체가 발달과정에 영향을 미치는지 확인하기 위해, mTORC1의 억제제인 50 nM rapamycin의 존재 하에서 다세포 발달과정을 조사하였다. 야생형 세포는 50 nM 라파마이신에서 일부 다중 팁을 형성했는데, 이는 TORC1 복합체가 발달과정, 특히 발달과정의 팁 형성 단계에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 RapC 가 TOR 복합체 경로 조절을 통해 Dictyostelium 발달과정에 관여하고 있음을 시사한다. 딕티오스텔리움에서 RapA와 RapC는 세포 부착과 세포 이동에서 서로 반대 기능을 하는 것으로 보고되었다. RapC는 C-말단에 RapA보다 긴 아미노산 꼬리를 가지고 있다. RapC의 C-말단이 RapA의 말단에 융합되면 RapA의 기능이 역전되었다. 재조합 RapA- CT는 세포 부착과 세포 이동에서 RapC와 동일한 기능을 가졌다. 본 연구에서, RapC의 C-말단이 Ras 단백질의 기능을 역전되는지 확인하기 위해, Ras 단백질 중 RapA와 가장 유사한 기능을 하는 RasG 말단에 RapC의 C-말단을 융합시켰다. 이후, RapC의 C-말단과 융합된 RasG (RasG-CT)는 rapC null 세포와 rasG null 세포에 발현되었고, 표현형은 야생형 세포의 표현형과 비교되었다. RasG-CT 를 발현하는 rapC null 세포는 야생형 세포보다 확산된 세포 형태를 보였고 부착력이 증가하였다. 발달과정에서 RasG-CT 를 발현하는 rapC null 세포는 다중 팁을 형성하였다. 주화성 이동에서는 야생형 세포에 비해 이동속도가 크게 감소하였다. 이러한 결과들은 rapC null 세포의 표현형과 동일했다. 이는 RapC의 C-말단이 RasG의 기능을 역전시킬 수 없음을 시사한다. 한편, rasG null 세포는 야생형 세포에 비해 세포 크기와 접착력이 감소한 것으로 나타났다. 발달 과정에서 rasG null 세포는 야생형보다 작은 크기의 포자를 형성하였다. RasG-CT를 발현하는 rasG null 세포는 세포 형체, 부착력 및 발달과정에서 야생형 세포의 표현형과 유사했다. 무작위 세포 이동에서 rasG null 세포는 야생형 세포보다 높은 이동 속도를 보였지만 RasG-CT를 발현하는 rasG null 세포는 야생형 세포와 비슷한 이동 속도를 보였다. 주전성 이동에서 rasG null 세포는 야생형 세포보다 이동 속도가 증가하고 방향성이 감소한 것으로 나타났다. rasG null 세포의 이러한 표현형은 RasG-CT의 발현에 의해 복원되었다. 이러한 결과들은 RapC의 C-말단이 Rap 단백질의 기능을 역전시킬 수 있지만 다른 Ras 단백질은 역전시킬 수 없음을 시사한다.