Regulation of Cell Adhesion by RapB and Roles of NHE1 in Cell Migration and Phagocytosis

Abstract

Regulation of Cell Adhesion by RapB and Roles of NHE1 in Cell Migration and Phagocytosis Uri Han Advisor: Prof. Taeck Joong Jeon, Ph.D. Department of Life Science Graduate School of Chosun University Ras proteins are small monomeric GTPases acting as molecular switches in various cellular signaling pathways, including cell migration, polarity, differentiation, and apoptosis. There are three Rap proteins (RapA, RapB, and RapC) in Dictyostelium. RapA, the closest homolog of human K-Ras, plays an essential role in integrin-mediated cell-substrate adhesion, cadherin-mediated cell-cell adhesion, cell migration, and proliferation. It has been reported that RapC has opposite functions to RapA in cell migration and adhesion and plays an unique important role in multi-tip formation in multicellular development of the cells. Contrary to RapA and RapC, RapB remains uncharacterized yet though RapB has high homology to RapA (Rap1). To investigate the functions of RapB, cells with deletion of the rapB gene were generated using the CRISPR/Cas9 gene editing system. Using the rapB mutated cells (rapB null), I examined the phenotypes of the cells in cell adhesion and migration. rapB null cells showed decreased cell size and adhesion strength compared to wild-type cells. In chemotaxis using cAMP as a chemoattractant, rapB null cells showed increased migration speed toward chemoattractants. These phenotypes were rescued by expression of RapA as well as by expression of RapB, but not by RapC. These results suggest that RapB has an inhibitory function in chemoattractant-mediated cell migration possibly through controlling cell-substrate adhesion. These functions of RapB in regulating cell migration and adhesion are similar to those of RapA but opposite to those of RapC. NHE1 is a sodium-hydrogen antiporter located in the plasma membrane of cells. In Dictyostelium discoideum, NHE1 plays an essential role in maintaining cell polarity and intracellular pH homeostasis. NHE1 regulates migration speed and orientation of cells in chemotaxis through regulation of cell polarity. To determine whether NHE1 plays a similar role in elecrtoraxis as in chemotaxis, I investigated directional cell migration in response to electric fields (EF). Electrotaxis was performed using vegetative cells or aggregation-competent cells. Vegetative nhe1 null cells exhibited decreased migration speed and directionality in both electrotaxis and chemotaxis using folates, which are secreted by the bacteria, as chemoattractants. Using the intracellular calcium marker GCaMP3, I confirmed the intracellular calcium level of cells. nhe1 null cells showed delayed calcium elevation kinetics in response to folic acid, suggesting that NHE1 might be involved in phagocytosis which are mediated by folic acid secreted by bacteria. As expected, cells lacking NHE1 showed slower growth rate and smaller colonies on the bacteria growing plates, compared to wild-type cells. These results suggest that NHE1 plays an important role in regulating migration speed and directionality in both electrotaxis and chemotaxis in the vegetative state. In addition, NHE1 appears to be involved in the regulation of phagocytosis.|RapB에 의한 세포 부착 조절과 세포 이동 및 식균 작용에서 NHE1의 역할 한 우 리 지도교수: 전 택 중 글로벌바이오융합학과 조선대학교 대학원 Ras 단백질은 세포 이동, 극성, 분화 및 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 신호 경로에서 분자적 스위치 역할을 하는 작은 단량체 GTPase입니다. Dictyostelium에는 세 개의 Rap 단백질 (RapA, RapB, 그리고 RapC)이 있습니다. 인간의 K-Ras와 가장 가까운 상동체인 RapA는 integrin 매개 세포-기질 부착, cadherin 매개 세포간 부착, 세포 이동 및 증식에 필수적인 역할을 합니다. RapC는 세포 이동 및 부착에서 RapA와 상반된 기능을 하며, 세포의 다세포 발달에서 다중 팁 형성에 독특하고 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다. RapB는 RapA와 RapC와는 달리 RapA(Rap1)와 높은 상동성을 가지고 있음에도 불구하고 아직까지 그 기능이 밝혀지지 않은 상태입니다. RapB의 기능을 조사하기 위해 크리스퍼 유전자가위(CRISPR/Cas9) 시스템을 이용하여 rapB 유전자가 결실된 세포를 제작하였습니다. rapB 돌연변이 세포 (rapB 결손 세포)를 이용해 세포 부착과 이동에 있어 세포의 표현형을 확인한 결과, rapB 결손 세포는 야생형 세포에 비해 세포 크기와 부착 강도가 감소한 것으로 나타났습니다. 화학유인물질로 cAMP를 사용한 주화성 이동에서 rapB 결손 세포는 화학유인물질을 향한 이동속도가 증가했습니다. 이러한 표현형은 RapA의 발현과 RapB의 발현에 의해 회복되었지만, RapC의 발현에 의해 회복되지는 않았습니다. 이러한 결과는 RapB가 세포-기질 부착을 제어함으로써 화학유인물질 매개 세포 이동을 억제하는 기능을 가지고 있음을 시사합니다. 세포 이동과 부착을 조절하는 RapB의 이러한 기능은 RapA와 유사하지만 RapC와는 반대입니다. NHE1은 세포의 원형질막에 위치한 나트륨-수소 역수송체입니다. Dictyostelium discoideum에서 NHE1은 세포 극성 및 세포 내 pH 항상성을 유지하는데 필수적인 역할을 합니다. NHE1은 세포 극성 조절을 통해 세포의 이동 속도와 방향을 조절하여 세포의 주화성 이동을 조절합니다. NHE1이 주화성 이동과 마찬가지로 주전성 이동에서도 유사한 역할을 하는지 확인하기 위해, 전기장 (EF)에 반응하는 방향성 세포 이동을 조사하였습니다. 발달상태의 세포 또는 응집 능력이 있는 세포를 이용하여 주전성 이동을 수행하였습니다. 발달상태의 nhe1 결실 세포는 주전성 이동과 박테리아가 분비하는 엽산을 화학유인물질로 이용한 주화성 이동 모두에서 이동 속도와 방향성이 감소하는 것으로 나타났습니다. 세포 내 칼슘 마커 GCaMP3를 사용하여 세포 내 칼슘 수준을 확인하였습니다. nhe1 결실 세포는 엽산에 반응하여 칼슘 상승 역학이 지연되는 것으로 나타나 NHE1이 박테리아가 분비하는 엽산을 매개로 하는 식세포 작용에 관여할 수 있음을 시사하였습니다. 예상대로, NHE1이 결핍된 세포는 야생형 세포에 비해 성장 속도가 느리고 박테리아가 증식하는 플레이트에서 더 작은 콜로니를 보였습니다. 이러한 결과는 NHE1이 발달상태의 주전성 이동과 주화성 이동 모두에서 이동 속도와 방향성을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 또한, NHE1은 식세포 작용의 조절에서 관여하는 것으로 보여집니다.