Expression study of the metastasis suppressor gene CD82 by DNA methylation in gastric cancer

Abstract

Gastric cancer is a type of cancer with a high incidence and mortality worldwide. Most of them occur in Asia, especially in East Asia. When gastric cancer metastasizes, the survival rate decreases drastically. Metastasis is one of the characteristics of cancer and refers to the movement from the primary cancer site to distant organs. CD82, one of the metastasis suppressor genes and belonging to the tetraspanin super family, is also known as a protein called KAI1. Although CD82 acts as a metastasis suppressor gene in many cancer types, CD82 is mostly down-regulated during cancer progression, and the exact cause is not known. Therefore, in this study, Iaimed to verify the role of CD82 in gastric cancer and investigate the mechanism of epigenetic modificationthat downregulates CD82. The patient group with low CD82 expression showed a poorer prognosis than the patient group with high CD82 expression, and it was confirmed that CD82 expression decreased during metastasis in gastric cancer patients. When the expression of CD82 was checked in ten gastric cancer cell lines and one normal gastric epithelial cell line to confirm whether it was actually down-regulated in gastric cancer, CD82 expression was found to be down-regulated in most gastric cancer cell lines. To determine whether CD82 actually acts as a metastasis suppressor gene, CD82 expression was controlled in gastric cancer cell lines using CD82-specific small interfering RNA and an over-expression plasmid vector. Decreased CD82 expression increased invasion and migration of gastric cancer cells, while over-expression of CD82 decreased invasion and migration. Additionally, regulating the expression of CD82 affected the changes in epithelial-mesenchymal transition related genes, which play an important role in the metastasis of cancer cells. Through this, it was confirmed that CD82 affects metastasis in gastric cancer. DNA methylation was expected to be a factor in the down-regulation of CD82 expression, and it was confirmed that CD82 expression increased upon treatment with a demethylating agent 5-AZA-2´-deoxycytidine. Through methyl-specific PCR, it was confirmed that CD82 was actually hypermethylated. DNA methylation was expected to be a factor in the down-regulation of CD82 expression, and it was confirmed that CD82 expression increased upon treatment with the demethylating agent 5-AZA. Through methyl-specific PCR, it was confirmed that CD82 was actually hypermethylated. Additionally, CD82, whose expression increased due to demethylating agent treatment, similarly reduced migration. This study shows that CD82 functions as a metastasis suppressor gene by reducing cell mobility in gastric cancer, and that the expression of CD82 can be regulated by DNA methylation during the progression of gastric cancer. These results suggest the possibility of CD82 as a target gene in the diagnosis of gastric cancer and are expected to help reveal the epigenetic mechanism of CD82.|위암에서 DNA 메틸화에 의한 전이 억제 유전자 CD82의 발현 연구 박 지 웅 지도교수 : 김석준 글로벌바이오융합학과 조선대학교 대학원 위암은 전 세계적으로 높은 발병률과 사망률을 보이는 암종이다. 대부분이 아시 아에서 발생하며 그중에서도 동아시아에 특이적으로 발생한다. 위암은 전이가 발 생하면 생존율이 급격하게 감소한다. 전이는 암의 특성 중의 하나로 원발 암 부위 에서부터 멀리 떨어진 기관으로 이동하는 것을 말한다. 전이 억제 유전자 중의 하 나이며 tetraspanin super family에 속하는 CD82는 KAI1 이라고 하는 단백질로도 알려져 있다. 여러 암종에서 CD82가 전이 억제 유전자로써 작용하지만, CD82는 암 의 진행 시 대부분 하향조절 되어있으며 정확한 원인은 밝혀져 있지 않다. 따라서 이번 연구에서는 위암에서의 CD82의 역할에 대해 검증하고 CD82를 하향조절 하는 후생유전학적 조절에대한 기전에 대하여 알아보고자 한다. CD82 발현이 낮은 환자군은 높은 환자군에 비하여 좋지 않은 예후를 보였으며 위암 환자에서 전이의 진행 시 CD82의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 실제 위암에서 하향조절 되어있는지 확인하기 위해 열 가지의 위암 세포주와 한 가지의 정상위 상피 세포주에서 CD82의 발현을 확인하였을 때 대부분의 위암 세포주에서 낮은 발현을 보였다. CD82가 실제로 전이 억제 유전자로서 역할을 하는지 알아보기 위해 CD82 특이적인 작은 간섭 RNA와 과발현 플라스미드 벡터를 이용하여 위암 세포주에서 CD82의 발현을 조절하였다. CD82 발현의 감소는 위암 세포의 침습과 이동을 증가시켰으며, CD82의 과발현은 반대로 침습과 이동을 감소시켰다. 추가로 CD82의 발현조절은 암세포의 전이에 중요한 역할을 하는 상피-중간엽 전이 관련 유전자들의 변화에 영향을 미쳤다. 이를 통해 위암에서 CD82가 전이에 영향을 미치는 것을 확인하였다. CD82의 발현이 하향되어있는 요인으로써 DNA methylation을 예상하였고 탈메틸화제 5-AZA-2´-deoxycytidine 처리 시 CD82의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 메틸 특이적 PCR을 통해 실제로 CD82가 과 메틸화되어있음을 확인하였다. 또한 탈메틸화제 처리로 인한 CD82 발현의 증가는 세포의 이동성을 감소시켰다. 이 연구는 CD82가 위암에서 세포의 이동성을 감소시킴으로써 전이 억제 유전자로써의 기능을 하며, 위암의 진행 중 DNA methylation 에 의해 CD82의 발현이 조절될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 위암의 진단에 표적 유전자로써 CD82의 가능성을 제시하며 CD82의 후성유전학적 조절에 대한 기전을 밝히는 데에 도움을 줄 것이라고 예상한다.