A robust analytic method for total RNA-seq and its application in early diagnosis of Alzheimer’s disease using transcriptomic risk score

Abstract

최근 다양하고 세밀한 전사체 분석이 가능해지며 질병의 진단과 예후 및 병기의 예측 그리고 치료 등과 같은 다양한 임상 분야의 생체지표 발굴에 전사체 데이터가 널리 활용되고 있다. 그 결과 정복할 수 없을 것으로 여겨지던 여러 종류의 암과 알츠하이머병 치매와 같은 퇴행성 질환 등의 유전적 소인을 밝혀내어 질병의 근본적인 이해와 정복에 가까워질 수 있었다. 하지만 제한된 임상 환경에서 고품질의 시료를 얻거나 저품질의 시료를 분석하는 일은 여전히 도전적인 과제로 남아있으며 이로 인해 귀중한 시료들이 낭비되고 있다. 특히 근래 생체지표 발굴 연구에 활발히 활용되고 있는 전전사체 염기서열자료 (total RNA-seq)의 경우 그 특성을 고려하지 않고, 기존 전령알엔에이 염기서열자료(mRNA-seq)기반의 분석법이 관행처럼 적용되어 오고 있어 적합한 분석법의 개발이 필요한 상황이다. 이 연구에서는 기술적 복제 시료를 사용하여 전전사체 염기서열자료(total RNAseq)에 최적화된 전처리 방법을 개발하고 여러 체계적인 분석들을 통하여 그 유효성을 입증하였다. 제안된 방법은 기존 방법에서 무시되었던 전사 정보를 추가로 탐지하고 상대적으로 낮은 품질의 전전전사체 염기서열 데이터(total RNA-seq)로부터 안정적인 발현 탐지 및 분석을 수행할 수 있으며 특히 시료의 품질이 낮은 제한된 표본을 분석할 때 유용하다. 이어, 우리는 해당 방법을 독립된 임상 자료들에 적용함으로써 보다 객관적인 분석을 통해 제안 방법을 검증하였으며, 사용된 자료에는 65 세 이상 한국인 지연 발현 알츠하이머병 환자(Late onset Alzheimer’s disease)를 대상으로 얻은 혈액 전전사체 염기서열 자료(total RNA-seq)가 포함되어 이를 통해 뇌의 비가역적 손상으로 인해 조기 진단의 중요성이 대두되고 있는 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 혈액 생체 지표를 발굴하고 검증하였다. 영상 전사체학을 통해 알츠하이머병의 병리학적 변화와 연관된 23 개의 후보 유전자를 발견하였으며, 이 유전자들을 독립된 여러 데이터를 통해 객관적으로 검증하고 더 나아가 실제 임상평가에서 적용 가능한 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 최적의 절삭점을 제안한다.|Recently, various and detailed transcriptome analysis has been possible, and transcriptome data has been widely used to discover biomarkers in various clinical fields such as disease diagnosis, prognosis, stage prediction, and treatment. As a result, we were able to uncover the genetic predisposition to various types of cancer and degenerative diseases such as Alzheimer's disease that were thought to be unconquerable, bringing us closer to fundamental understanding and conquest of the disease. However, obtaining high-quality samples or analyzing low-quality samples in limited clinical environments remains a challenge, which results in the waste of valuable samples. In particular, in the case of total RNA-seq, which has been actively used in recent biomarker discovery research, the existing mRNA-seq based method has been applied as a custom without considering its characteristics, so the development of a suitable analysis method is necessary. In this study, we developed an optimized preprocessing method for total RNA-seq using technical replicate samples and evaluated its effectiveness through several systematic analyses. The proposed method can additionally detect transcript reads that was ignored in existing methods and perform stable expression detection and analysis from relatively low-quality total RNA-seq. In particular, it is useful when analyzing limited samples with low quality of RNA. Subsequently, we validated the proposed method through a more objective analysis by applying the method to independent clinical data. This includes blood-based total RNA-seq obtained from Koreans aged 65 or older with Late onset Alzheimer's disease (LOAD), we discovered and evaluated the blood biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease where importance of early diagnosis is increasingly due to irreversible damage to the brain. Through imaging transcriptomics, 23 candidate genes associated with pathological changes in Alzheimer's disease were discovered, we objectively evaluate these genes in several independent datasets and further propose an optimal cut-off for early diagnosis of Alzheimer's disease that can be applied in actual clinical assessment.