Antibacterial Activity and Mechanistic Investigation of Neuropeptide PACAP and its Analogs

Abstract

Antibacterial Activity and Mechanistic Investigation of Neuropeptide PACAP and its Analogs Yeeun Lee Advisor : Prof. Yoonkyung Park, Ph. D. Department of Integrative Biological Sciences Graduate School of Chosun University The development of antibiotics has had a significant impact on the development of modern medicine, enabling treatment and eradication of numerous serious infectious diseases. However, bacteria acquire resistance to neutralize antibiotic activity to survive, and numerous strains that are resistant to existing antibiotics have emerged. These antibiotic-resistant strains have rapidly spread and emerged as a serious problem worldwide, and it is therefore urgent to develop novel treatments against them. Antimicrobial peptides (AMPs) are promising novel treatment options that can be used to address these problems. AMPs are host defense peptides consisting of 10–50 amino acids that are found in most organisms. AMPs have a variety of antibacterial active mechanisms and exhibit strong anti-microbial activity against a wide range of microorganisms, including fungi, viruses, and bacteria. Pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide (PACAP) is a neuropeptide secreted by several tissues and organs in the body, including the pituitary gland. It exists in two primary forms, PACAP38 and PACAP27, and plays a role in a wide range of physiological activities, including neural functions and stress responses. In addition, PACAP has been reported to play a significant role in the host immune system, and recent studies identified PACAP as a potentially direct defensive agent against infections. In the present study, PACAP and its analog peptides were designed and their antibacterial activity and mechanism were studied. Seven analog peptides were designed from PACAP38 and one analog peptide was designed from PACAP27. Among the parent peptide PACAP38 and analog peptides, PACAP (18-38) and PACAP (11-27)-16I exhibited extensive antimicrobial activity similar to that of human cathelicidine LL-37 and the bee venom-derived peptide melittin. We evaluated the antimicrobial activity of analog peptide PACAP (18-38) against gram-positive and negative strains with antibiotic resistance. PACAP (18-38) maintained strong antimicrobial activity compared with PACAP38 in the gram-negative strains. In 23 Klebsiella pneumoniae strains with antibiotic resistance from patients in the infectious medicine department of Asan Medical Center (ASKP), PACAP (18- 38) demonstrated the same or better antimicrobial activity as the parent peptide. In addition, evaluation of the biofilm formation inhibition ability of PACAP38 and the analog peptide PACAP (18-38) confirmed that it has biofilm inhibition ability similar to that of the control peptides LL-37 and melitin against carbapenem-resistant K. pneumoniae strains (ASKP 1-3). The cytotoxicity was analyzed using human fibroblasts (Hs27) and red blood cells, and the analog peptide PACAP (18-38) was determined to be significantly less toxic than the parent peptide PACAP38. In addition, a circular dichroism (CD) was used to analyze the secondary molecular structure in a bacterial membrane-like environment. Both PACAP38 and its analog peptides had alpha-helix structures that were advantageous for direct interaction with bacterial membranes. Bacterial membrane permeability analysis of peptides was conducted using various methods, including N-phenyl-1-naphthylamine (NPN), a hydrophobic fluorescent dye; 3,3’-Diprophylthiadicarbocyanine iodide (DiSC3(5)), a voltage-sensitive dye used to assess bacterial membrane permeability based on potential differences; and bacterial circular membrane permeability analysis using the high-affinity nucleic acid dyes SYTOX Green and propidium iodide (PI). These analyses confirmed that PACAP38 and its analog peptides act directly on the bacterial membrane, leading to its destruction and antimicrobial activity. Consequently, this study demonstrates the potent antimicrobial activity and biofilm formation inhibition capabilities of PACAP38 and its analog peptide PACAP (18-38), suggesting their potential as treatments for antibiotic-resistant bacteria.|신경펩타이드 PACAP과 그 유도체의 항균 활성 및 작용기작 연구 이 예 은 지도교수 : 박 윤 경 글로벌바이오융합학과 조선대학교 대학원 항생제의 개발은 현대의학의 발전에 지대한 영향을 미쳤으며, 인류는 여러 심각한 감염병으로부터 벗어날 수 있게 되었다. 하지만 박테리아는 살아남기 위한 방법으로 항생제의 활성을 무력화시키는 저항력을 획득하였고 기존 항생제에 내성을 갖는 항생제 내성균주가 출현하였다. 이러한 항생제 내성균주는 급속도로 확산되며 전세계적으로 심각한 문제로 부상하였고, 이를 극복하기 위한 새로운 치료법의 개발이 시급하다. 항균펩타이드는 (antimicrobial peptides, AMPs) 이러한 문제를 해결할 수 있는 새로운 치료제 중 하나로 각광받고 있다. AMPs 는 10-50 개의 아미노산으로 이루어진 숙주 방어 펩타이드로 대부분의 생물체에서 발견된다. AMPs는 다양한 항균활성 기작으로 박테리아뿐 아니라, 곰팡이, 바이러스, 기생충 등 광범위한 미생물에 대해 강력한 항미생물 활성을 나타낸다. PACAP (Pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide)은 뇌하수체를 포함한 체내 다양한 조직에서 분비되는 신경 펩타이드로 체내에서 PACAP38 과 PACAP27 두 가지 형태로 존재하며, 다양한 신경 활동, 스트레스 반응 등 여러 생리학적 활성을 나타낸다. 또한, PACAP 은 체내 면역시스템에서도 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며, 최근 PACAP 이 감염에 대한 직접적인 방어물질로서 역할을 할 수 있을 것이라는 가능성이 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 PACAP과 그 유사체 펩타이드를 설계하여 항균활성 기전을 연구하였다. PACAP38에서 7개의 아날로그 펩타이드를 설계하였고, PACAP27 로부터 한 개의 아날로그 펩타이드를 설계하였다. 그들의 항균 활성 능력을 평가한 결과 모체 펩타이드인 PACAP38과 유사체 펩타이드 중, PACAP (18-38), PACAP (11-27)-16I가 대조군 펩타이드로 사용된 인간 카텔리시딘 LL-37, 벌독 유래 펩타이드 Melittin과 유사한 광범위한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다. 그중, PACAP (18-38)은 K. pneumoniae 균주에서 모체 펩타이드 PACAP38과 같은 강력한 항균활성을 유지하였으며, 아산병원 감염내과의 환자로부터 분리된 23개 K. pneumoniae 내성균주들 (ASKP)에 대해 모체펩타이드와 같거나 더 뛰어난 항균 활성을 나타냈다. 인간 섬유아세포 (Hs27)와 적혈구 세포를 사용하여 펩타이드의 세포독성도를 확인한 결과 유사체 펩타이드 PACAP (18-38)이 모체 펩타이드 PACAP38 보다도 독성이 현저히 낮음을 확인하였다. 또한, PACAP38 과 유사체 펩타이드 PACAP (18-38)의 생물막 형성 억제 능력을 평가한 결과에서 항생제 내성균주들 (ASKP 1-3)에 대해 대조군 펩타이드 LL-37 및 Melittin과 유사한 생물막 억제능력을 가짐을 확인하였다. 또한, 원평광 이색성 분광장치 (Circular dichroism, CD)를 사용하여 박테리아 막 유사 환경에서 이차 구조를 분석하였다. PACAP38 과 유사체 펩타이드 모두 박테리아 막과의 직접적인 상호작용에 유리한 구조인 알파-나선 구조를 가졌다. 소수성 형광 염료인 N-phenyl- 1-naphthylamine (NPN)을 이용한 펩타이드의 박테리아 외막 투과성 분석과 전압 민감 염료인 3,3‘-Diprophylthiadicarbocyanine iodide (DiSC3(5))를 이용한 전위차에 따른 박테리아 막 투과성 분석, 고친화도 핵산 염색제인 SYTOX Green, Propidium iodide (PI)를 이용한 박테리아 원형질막 투과성 분석을 통해 PACAP38 과 유사체 펩타이드가 박테리아 막에 직접적으로 작용하고 막을 파괴하여 항균활성을 나타내는 기전을 확인하였다. 결과적으로, 본 연구는 PACAP38과 그 유사체 펩타이드 PACAP (18-38)이 강력한 항균 활성 및 생물막 형성 억제 능력을 갖고 있음을 입증하였으며, 따라서 항생제 내성균에 대한 유망한 치료제로서 기능할 수 있음을 나타낸다.