Effects of berberine chloride on skin whitening and autophagy activation in cultured melanoma cells

Abstract

Skin is influenced by a diverse of intrinsic and extrinsic factors, including the accumulation of cellular damage, age, stress, smoking, and ultra violet (UV)-light exposure. These factors lead to skin aging associated with abnormal pigmentation, wrinkles, inflammatory response and skin cancer. Autophagy is known as a cellular self-digestion process and plays an important role in maintaining cellular homeostasis. In this process, unwanted components such as denatured proteins, damaged organelles, and pathogens are delivered to lysosome for degradation and recycling. Berberine chloride (named BBC) routinely used in this study is an isoquinoline alkaloid deprived from various plants such as barberry and goldenseal. A few studies have shown that BBC exhibits anti-viral and anti-cancer activities. However, BBC’s effects on skin whitening and autophagy have not yet been clarified in detail. Therefore, the this study attempted to investigate how BBC affects skin whitening and autophagy activation in a melanoma cell line called B16-F1. The tyrosinase zymography using L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) as a substrate showed that tyrosine activity could be inhibited by the BBC. The effects of BBC on the expressions of ERK and melanogenesis-related proteins (MITF, CREB, TRP-1, and tyrosinase) were also analyzed by Western blottings. As a result, BBC could increase the expressions of p-ERK, but decrease those of MITF, TRP-1, tyrosinase, CREB, and p-CREB in B16-F1 cells. In addition, BBC could decrease the melanin synthesis in B16-F1 cells in a concentration-dependent manner. These data suggest that BBC can suppress the melanin synthesis by not only inhibiting intracellular tyrosinase activity, but also by reducing the production of p-CREB and inducing MITF degradation through ERK phosphorylation, which are eventually reducing the expression of tyrosinase and TRP1. In this study, the effect of BBC on autophagy activation was also investigated. The expression levels of MAP kinases (ERK, p38, and JNK) and typical autophagic proteins (LC3, Atg12, and Beclin-1) were increased, as judged by Western blottings. These results suggest that BBC can activate the cellular autophagic system by activating MAP kinases. The effects of BBC on the autophagy activation and the melanian production were further analyzed in B16-F1 cells transfected with various small interfering RNAs (siRNAs) specific to Atg5, Beclin1, mTOR, and ERK. In the cells transfected with mTOR (negative autophagic regulator) siRNA, the synthesis of melanin pigments seemed to be increased slightly by BBC treatment, compared to that in the non-transfected group. In addition, in the cells transfected with siRNAs against Atg5, Beclin1, and ERK, the melanin synthesises could be increased significantly by BBC treatment in a concentration-dependent manner. These data clearly suggest that BBC can suppress the production of melanin by activating the autophagy system. Taken together, the results obtained by this study demonstrate that BBC can not only suppress skin aging, but also exhibit whitening effects by controlling the melanin production through the activation of the autophagic system that regulates skin cell homeostasis.| 피부는 나이, 호르몬 변화, 스트레스, 흡연, 자외선 노출을 포함한 다양한 내재적 그리고 외재적 요소들로부터 영향을 받는다. 이러한 요소들은 비정상적인 색소침착, 주름, 염증 반응 및 피부암과 관련된 피부 노화를 유도한다. Autophagy는 기능을 다한 단백질, 세포소기관 및 병원체 등, 세포 내 불필요 구성요소들이 리소좀(lysosome)에서 분해되어 재활용되게 하는 세포 내 소화과정이며, 세포의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 한다. 본 연구에 사용된 berberine chloride(BBC로 명명함)는 매자나무 및 황련과 같은 다양한 식물에 존재하는 이소퀴놀린 알칼로이드(isoquinoline alkaloid)이며, 이 화합물은 항멜라닌생성(anti-melanogenesis), 항염증(anti-inflammatory) 및 항바이러스(anti-viral) 등과 같은 다양한 효과를 지니는 것으로 알려져 있다. 그러나 피부미백과 autophagy에 미치는 BBC의 영향은 자세히 연구되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 흑색종 세포주인 B16-F1 세포에서 BBC가 피부미백 및 autophagy 활성화에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)를 기질로 tyrosinase zymography를 수행한 결과, 세포내 tyrosinase 활성이 BBC에 의해 억제됨을 확인하였다. 또한 Western blotting으로 BBC에 의한 MAP kinase(ERK)와 멜라닌 생성 관련 단백질들(CREB, MITF, Tyrosinase, TRP-1 등)의 발현양상을 분석하였다. 그 결과, BBC는 B16-F1 세포에서 p-p38, p-ERK, p-JNK의 발현을 증가시켰으나, CREB, p-CREB, MITF, tyrosinase, TRP-1 등의 발현은 감소시킴을 확인하였다. 또한 B16-F1 세포에 BBC를 67.5시간 처리하였을 때, 멜라닌 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 BBC가 세포 내 tyrosinase 활성을 직접적으로 저해할 뿐만 아니라, p-CREB의 생성을 감소시키고, ERK 인산화를 통해 MITF 분해를 유도함으로써 tyrosinase와 TRP1의 발현을 감소시켜 멜라닌 합성을 억제시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 본 연구에서는 또한 autophagy 활성화에 미치는 BBC의 영향을 조사하였다. B16-F1 세포에 BBC를 처리한 후, autophagy 유도 단백질들의 발현 양상을 Western blotting으로 분석한 결과, MAP kinase(p38, ERK 및 JNK), Beclin-1, Atg12 및 LC3 발현이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 BBC가 MAP kinase들의 활성화를 통해 autophagy system을 활성화시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 또한 autophagy 활성화와 멜라닌 생성에 미치는 BBC의 영향을 mTOR, Atg5, Beclin1 및 ERK에 대해 특이적인 small interfering RNA(siRNA)를 주입한 B16-F1 세포에서 분석하였다. 그 결과, autophagy system의 음성 조절자(negative regulator)인 mTOR에 대한 siRNA를 도입한 세포에서는 도입하지 않은 세포에 비해 BBC에 의해서 멜라닌 합성이 약간 증가함을 확인하였다. 반면, 양성 조절자(positive regulator)들인 Atg5, Beclin1 및 ERK에 대한 siRNA를 도입한 세포에서는 BBC에 의해 멜라닌 합성 상당히 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 BBC가 autophagy system을 활성화시킴으로써 멜라닌 합성을 억제시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 결론적으로 본 연구에서 얻은 연구결과들은 BBC가 피부세포의 항상성을 조절하는 autophagy 시스템의 활성화를 통해 멜라닌 생성을 제어함으로써 피부의 노화를 억제할 수 있을 뿐만 아니라 미백효과를 발휘할 수 있을 가능성을 시사하는 것이다.