Antimicrobial Activity and Mechanism of Antimicrobial Peptide Lip1 Derived from Lipotes vexillifer

Abstract

Since their discovery, antibiotics have been widely used as therapeutic agents against infectious disease. However, their indiscriminate use has led to rapid emergence of antibiotics resistant strains. Multidrug resistant bacterial are widespread in hospitals and pubic environments. The ESKAPE pathogen (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Kelbsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii and Enterobacter species) are characterized by increased levels of resistance towards multiple class of first line and last-resort antibiotics. Therefore, development of novel antibiotic alternative drugs is urgenly needs. Alternative antibiotics treatment are antimicrobial peptides (AMPs) have been potential antimicrobial activity also, show diverse mechanism of action (membrane disruption or membrane penetration). In this study, Lip1 isolated from Lipotes vexillifer and is composed 32 amino acids. The secondary structure of Lip1 in artificial bacterial membrane environments showed a random coil structure. Lip1 showed antimicrobial activity against 13 strains of S. aureus isolated from patients of Eulji hospital. The cytotoxicity and hemolytic activity of Lip1 was lower than of melittin isolated from bee venom. Liposome calcein leakage from the membrane-mimicking liposome showed that Lip1 has not toxic on mammalian cells or erythrocytes. Moreover, we confirmed that Lip1 could inhibit biofilm formed by S. aureus using crystal violet and SYTO9 staining. Lip1 was stable against physiological salts and human serum. Lip1 binds to the peptidoglycan and lipoteichoic acid. Lip1 had litter effect on bacterial membrane polarization or membrane integrity. To investigation Lip1 interaction with bacterial membrane performed cytoplasmic membrane depolarization using DiSC3(5) and membrane disruption using PI analysis revealed that Lip1 peptide penetrated the bacterial cell membrane. The Lip1 binds bacterial DNA, as evidenced in DNA gel retardation assay. Moreover, Lip1 induced oxidative stress through the generation of reactive oxygen species (ROS) in S. aureus. Additionally, Lip1 did not induce development of resistnace by S. aureus compared to conventional antibiotics such as oxacillin, vancomycin and ciprofloxacin. When S. aureus was incubated with RAW 264.7 cells, the pro-inflammatory cytokines increased. However, Lip1 significantly inhibited the increase in pro-inflammatory cytokine that were upregulated by S. aureus infection. The expression of the phosphorylated form of p-IκBα, p-p38 and NF-κB was downregulated after treatment with Lip1. These results indicate that Lip1 could be promising therapeutic agent for S. aureus infection.|과거에 박테리아 사멸을 목적으로 사용되었던 다양한 종류의 항생제들이 지나친 오남용과 잘못된 이용방식으로 인해 현재 전세계적으로 위협이 되고 있는 다제내성균주를 등장시키게 되었고, 이러한 결과는 어떤 항생제로도 죽일 수 없는 슈퍼박테리아를 만들어내는 최악의 상황을 초래하였다. 이러한 슈퍼박테리아는 지금도 전세계적으로 많은 위협이 되고 있으며 최근 코로나 19의 치료목적으로 무작위적으로 사용된 항생제로 인해 체내 다제내성균이 생겨나게 되면서, 코로나 바이러스에 못지 않게 슈퍼박테리아의 중요성도 대두되고 있는 상황이다. 이에 항생제를 대체할만한 새로운 대체제가 필요한 상황이며, 그 후보군 중 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)가 주목받고 있다. 항균 펩타이드는 다양한 생물체(동물, 식물 등)에서 분리 및 정제를 통하여 10-50개로 구성된 아미노산으로 구성된 작은 단백질 분자를 말한다. 이러한 항균 펩타이드는 병원체로부터 숙주세포를 보호하는 역할을 하며, 기존 항생제가 단순히 항균 및 항진균 효과를 가졌었다면, 항균 펩타이드는 항균, 항진균, 항염증, 낮은 독성 및 낮은 내성 유발로 효과가 있으며 항생제 대체 물질로써 각광받고 있다. 이전 연구에서 Lip1은 고래 종류의 하나인 Lipotes vexillifer의 프롤린이 풍부한 항균 펩타이드 서열이 소에서 유래된 항균효과가 뛰어난 Bac7 항균 펩타이드와 상동성을 가지는 것을 확인하였고, 4번째 액손 자리에 위치하는 C 말단 부위를 Lip1으로 명시하였다. 이전 연구에서는 그람 음성균을 중심으로 항균효과를 알아보았으며, 이번 연구에서는 그람 양성균인 S. aureus에 대해 항균활성을 측정하고 항생제에 내성을 가진 을지병원 환자로부터 분리된 내성균주를 가지고 실험을 진행하였다. 그람 양성균에 초점을 맞추어 그 중에서도 스타필로코커스 아우레스와 항생제 내성을 가지는 을지병원 내성균주 (13개 균주)를 가지고 항균 활성을 진행하였다. 대조군으로 사용된 벌독 유래의 Melittin과 비교하였을 때 비슷한 항균 활성을 보일만큼 Lip1의 항균활성은 뛰어났고, 적혈구(SRBC) 및 마우스 대식세포 (RAW 264.7 cells)에서 독성테스트를 진행한 결과에서 Melittin보다 훨씬 독성이 낮은 것을 확인하였다. 다음으로 Lip1의 생물막 억제 능력을 확인한 결과 Vancomycin과 유사하게 낮은 농도에서 생물막을 제거하는 것을, 박테리아 막을 모방한 조건에서의 펩타이드의 구조를 확인하기 위해 원편광 이색성 (Circular dichroism, CD)를 이용하여 이차구조를 분석한 결과, Lip1은 수용성 조건이나 박테리아 막 조건에서도 랜덤 코일형태를 띄는 것을 확인하였고, 위와 반대로 melittin은 알파 나선 구조를 가지는 것을 확인하였다. 또한 Lip1은 박테리아 막을 투과하는 대표적인 펩타이드인 Buforin 2와 비슷한 양상을 보였다. 실제 S. aureus 균주에 대한 사멸 메커니즘 기작을 알아본 결과, 박테리아의 원형질막 전위 변화를 보기 위한 DiSC3(5) 그리고 막 손상을 대표적으로 보여주는 PI 염색법을 진행한 결과 Lip1은 Buforin 2와 비슷한 박테리아 사멸 메커니즘을 가지는 것을 확인하였다. 박테리아의 항균 활성이 생리적 조건의 염에서도 유지가 되는지 알아보기 위한 1가, 2가, 3가 이온을 가지고 안정성 평가를 한 결과. Lip1은 염의 존재 하에서 Melittin보다 더 좋은 항균 활성을 가지는 것을 확인하였고, 또한 사람의 혈청을 이용한 안정성 검사에서는 6시간대에서 melittin이 Lip1보다 빠르게 분해되어 항균활성이 감소하는 것을 확인하였고, 이 결과는 Lip1이 melittin에 비해 뛰어난 안정성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다. Lip1이 내성을 유발하는지 30-계대 내성유발 실험을 한 결과 oxacillin, vancomycin, ciprofloxacin과 같은 치료 항생제는 30-계대 동안 15배 이상 MIC 값이 증가하였으며 내성이 유발되는 것을 확인하였습니다. 반면 Lip1은 내성을 30-계대 동안 2배로 MIC 값이 증가하면서 내성을 적게 유발한다는 것을 확인하였습니다. 따라서 Lip1은 항생제와 달리 내성을 적게 유발하는 효과적인 치료제가 될 수 있음을 시사합니다. 따라서 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 항생제 내성 S. aureus 균주 감염에 대한 효과적인 치료제로써 Lip1이 사용될 수 있다고 전망된다.