Molecular characterization of PepSTC and PepCYP involved in the biosynthesis of a novel phytoalexin in the transgenic N. benthamiana

Abstract

식물탄저병(Anthracnose)은 Colletotrichum 속 균주의 감염으로 일어나며 잎, 줄기, 열매에서 검은 반점과 괴사현상을 일으키는 질병으로써, 전염성이 강하고 감염된 식물의 폐기가 어려워서 경제적으로도 큰 타격을 줄 수 있는 질병이다. 본 연구에서는 고추의 잎에서 PepSTC와 PepCYP 유전자를 통해 Colletotrichum 속 균주의 관계를 확인하고, 담배에 일시적 과발현을 통해 phytoalexin의 합성에서 두 유전자의 분자적특성을 규명하고자 하였다. 고추의 병 방어작용과 PepSTC, PepCYP 유전자의 관계를 확인하기 위하여 elicitor, 식물호르몬을 처리하였으며, 잎 특이적 병원균인 Colletotirchum coccodes를 접종하였다. Realtime PCR을 통해 PepSTC와 PepCYP의 발현을 확인한 결과 elicitor와 Methyl jasmonate를 통해 발현이 증가하였으며, Methyl jasmonate와 ethephon을 동시에 처리하였을 때 시너지 효과에 의해 두 유전자의 발현이 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 담배에서 Agrobacterium을 통한 PepSTC와 PepCYP의 일시적 과발현을 확인하기 위해 형광단백질을 이용하여 재조합 단백질을 발현시켰다. 두 유전자의 발현을 유전자, 단백질 분석을 통해 확인하였으며, 형광분석 방법을 통해 세포 내에서 두 유전자의 발현 위치를 확인하였다. Phytoalexin합성에서 PepSTC와 PepCYP의 기능을 확인하기 위해 물질을 추출하고, 담배에서 C. coccodes의 저항성에 미치는 영향을 확인하였다. PepSTC와 PepCYP를 발현시킨 담배의 잎에서 대사물질을 추출하여 분석한 결과 PepSTC와 PepCYP를 발현시킨 담배에서 대사물질이 유도되었으며, 두 유전자를 동시에 발현시켰을 때 대사물질의 축적량이 증가하였다. 또한 담배에서 PepSTC와 PepCYP를 발현시키고 C.coccodes를 접종하여 관찰한 결과 대조군에 비교하여 접종 부위의 면적이 감소하였다. 이 결과는 PepSTC와 PepCYP의 발현을 통해 담배 잎에서 C. coccodes의 저항성을 상승시킨 것으로 보여진다.|Plant anthracnose (Anthracnose) is a disease that infects strains of the genus Colletotrichum, causing black spots and necrosis on leaves, stems, and fruits. It is also a highly contagious disease that is difficult to eliminate and can cause economic damage. In this study, I confirmed that the PepSTC and PepCYP genes are related with the resistance against Colletotrichum in the leaves of pepper. In addition, I characterizated in molecular level that PepSTC and PepCYP are involved in the biosynthesis of a novel phytoalexin through transient expression in N. benthamiana. To understand the microenvironmental conditions for inducing PepSTC and PepCYP expression, various defense-related phytohormones were treated together with the inoculation of C. coccodes, a leaf-specific pathogen. As a result of realtime PCR, the expression of both PepSTC and PepCYP increased when elicitor, methyl jasmonate and ethephon were treated simultaneously, which confirmed that the expression of both genes increased by synergistic effects of the defensive phytohormones and an elicitor. To confirm the transient overexpression of PepSTC and PepCYP in N. benthamiana, a fluorescent protein was used to monitor the expression of the recombinant protein. Expression of the PepSTC and PepCYP genes was confirmed through gene and protein analyes, and subcellular localization of the two recombinant proteins was confirmed through fluorescence analysis. To confirm the function of PepSTC and PepCYP in phytoalexin biosynthesis, metabolites were extracted and analyzed from tobacco leaves expressing PepSTC and PepCYP. Substances were extracted from post infiltraed leaves and the effect on the resistance against C. coccodes in N. benthamiana was verified. As a result, a novel phytoalexin was biosynthesized in tobacco expressing PepSTC and PepCYP. Additionally, when both genes were expressed simultaneously, the accumulation of the phytoalexin increased. As a result of the expression of PepSTC and PepCYP in tobacco and inoculation with C. coccodes, the lesion diameter decreased compared to the control group. This result indicated that the resistance against C. coccodes in tobacco increase through the expression of PepSTC and PepCYP.