애기장대의 Toll/interleukin-1 receptor 도메인을 암호화하는 AtTX11/12 유전자의 기능적인 분석

Abstract

Plants deploy various resistance (R) proteins to protect themselves from pathogen attacks. Although there exist 30 genes encoding Toll-interleukin-1 receptor-only protein (TX) belonging to non-canonical R proteins in the genome of Arabidopsis thaliana, the roles of only a few TXs have been elucidated yet. The overexpression of AtTX11/12 under the regulation of a root-specific enhancer trap line, Q2610 (Q2610>>AtTX11/12) led to severe growth inhibition, which was not suppressed under the high temperature condition. In this study I tried to screen the protein regions and essential amino acids for the growth inhibition and temperature-insensitive activity of AtTX11/12 by introducing various mutations. By using multiple sequence alignment and 3D structure modeling comparing to known plant TIR domains, it was shown that AtTX11/12 possess additional 6th α-helix (αF) in addition to shared 5 β-sheets (βA~βE) and 5 α-helices (αA~αE) among plant TIRs. C-terminal deletion analysis showed that CΔ3 containing 1~173 amino acids (a.a.) with intact αE maintained the activity whereas CΔ4 (1~163 a.a.) with truncated αE lacking 5a.a. located in αE lost the activity. These results indicate that the conserved 5 β-sheets and 5 α-helices are essential for the growth inhibition activity of AtTX12. By using site-directed mutagenesis it was confirmed that the conserved 24th serine and 25th histidine (AtTX12) present in AE (αA-αE) interface are essential for growth inhibition activity whereas the lysine-rich region present in C-terminal αF region is not. Furthermore, random point mutation study showed that 43th glutamate (AtTX11) present in BB (βB-αB)-loop and 150th lysine localized in βE composing putative BE (BB loop- βE) interface are essential for the activity. In addition, the 79th glutamate (AtTX11), a conserved putative NADase active site was also required for the growth inhibition activity. These results showed that the interactions through AE/BE interfaces and NADase activity are required for the function of AtTX11/12. Three AtTX12-like genes were polymerase chain reaction amplified using genomic DNA isolated from broccoli (Brassica oleracea var. italica), cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis), and white radish (Raphanus sativus), cloned and named BoiTX12, BobTX12 and RsTX12, respectively. Although the amino acid sequences of BoiTX12, BobTX12 and RsTX12 exhibited 65.2%, 65.2%, and 56.3% identity with that of AtTX12, the overexpression of RsTX12 induced strong growth inhibition in Arabidopsis seedlings whereas those of BoiTX12 and BobTX12 did not. To screen for the essential region and amino acids for the temperature-insensitive growth inhibition activity of AtTX11/12, the transgenic seedlings overexpressing various mutants active at 22℃ were moved and grown at 28℃ to examine the growth inhibition activity. CΔ3 of AtTX12 (1~173 a.a.) lost the growth inhibition activity at 28℃ whereas CΔ1 (1~193 a.a.) and CΔ2 (1~183 a.a.) maintained the activity. In addition, N36D (AtTX12) active at 22℃ lost the activity at 28℃. These results suggest that the C-terminal 174~183 a.a. region present between αE and αF of AtTX12 and 36th Asn present at βB would be essential for the temperature-insensitive growth-inhibition activity of AtTX12. To examine whether the ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1) is required for such temperature-insensitive growth inhibition activity, eds1-2 Q2610>>AtTX12 seedlings showing much weaker growth inhibition phenotypes compared with Q2610>>AtTX12 seedlings were grown both at 22℃ and 28℃ conditions where they show no difference in growth. These results suggest that the growth inhibition activity of AtTX12 might be mediated by 1) EDS1-dependent pathway and 2) EDS1-independent temperature-insensitive pathway. Therefore eds1-2 Q2610>>AtTX12 could be used as a proper genetic background for the novel growth-inhibition or disease-resistance pathway.|식물은 다양한 유형의 저항성 (R) 단백질을 활용하여 병원체의 공격으로부터 자신을 방어한다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 유전체에는 비표준적인 R 단백질인 Toll-interleukin-1 receptor only 단백질(TX)을 암호화하는 30개의 유전자들이 존재하지만 일부 TX들만의 기능이 밝혀진 바 있다. AtTX11/12의 과대발현(Q2610>>AtTX11/12)은 형질전환된 애기장대의 극심한 생장저해를 유도하였으며, 특히 고온 조건에서도 이러한 생장저해 활성은 유지되었다. 본 연구를 통해서 AtTX11/12에 다양한 돌연변이를 도입하여 생장저해능과 고온-비민감성 활성에 필수적인 AtTX11/12의 영역과 필수적인 아미노산들을 선별하고자 하였다. 다중서열정렬 프로그램과 3차원 구조 예측 프로그램을 활용하여 AtTX12와 구조가 밝혀진 식물 TIR 도메인의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, AtTX11/12에는 식물 TIR 도메인에 공통적으로 존재하는 보존된 5개의 β-sheet (βA~βE)들과 5개의 α-helix (αA~αE)들 외에도 추가적인 6번째 α-helix (αF)가 존재하는 것이 확인되었다. AtTX12의 C-말단 결실 돌연변이들을 제조하여 발현시킨 결과, C-말단 30개의 아미노산이 결실된 돌연변이[CΔ3, 1~173 amino acid (a.a.)]까지는 생장저해능이 유지되었지만 αE 구조에서 5개의 아미노산이 결실된 돌연변이(CΔ4, 1~163 a.a.)부터는 생장저해능이 완전히 소실되었다. 이 결과는 AtTX12가 생장저해능을 발휘하기 위해서는 식물 TIR 도메인에 보존된 5개의 β-sheet들과 5개의 α-helix들이 필수적이며, 추가적인 αF는 생장저해능에 필수적이지 않다는 것을 의미한다. 위치 유도 돌연변이의 연구를 통해서 식물 TIR 도메인의 상호작용에 핵심적인 AE (αA-αE) interface 상에 보존된 24번 세린과 25번 히스티딘(AtTX12)은 생장저해 활성에 필수적인 반면, C-말단의 αF 상에 위치한 라이신 풍부 지역은 필수적이지 않다는 것을 확인하였다. 또한 무작위적 돌연변이를 AtTX11/12에 도입하여 활성을 조사한 결과, 잠정적인 TIR 도메인 상호작용 장소인 BE (BB loop-βE) interface를 구성하는 BB (βB-αB)-loop 상의 43번 글루탐산(AtTX11)과 βE상에 위치하는 150번 라이신(AtTX12)이 생장저해 활성에 필수적이라는 것을 확인하였다. 그리고 잠정적인 NADase 활성 장소로써 보존된 79번 글루탐산(AtTX11)도 생장저해 활성에 필수적이었다. 이러한 결과는 AtTX11/12의 생장저해 활성은 유사한 식물 TIR들과 마찬가지로 AE/BE interface를 통한 상호작용과 NADase 활성에 의존적인 것을 의미한다. 배추과의 세 작물, 브로콜리(Brassica oleracea var. italica), 콜리플라워 (Brassica oleracea var. botrytis)와 무(Raphanus sativus)에서 AtTX12 유사 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하였다. 이들을 각각 BoiTX12, BobTX12, 그리고 RsTX12라고 명명하였고 이들이 암호화하는 아미노산 서열은 AtTX12와 각각 65.2%, 65.2%, 그리고 56.3%의 동질성을 나타냈다. 애기장대에서 BoiTX12와 BobTX12의 과발현은 생장저해능을 유도하지 못했지만, RsTX12의 과발현은 생장저해 활성을 나타냈다. AtTX11/12의 고온 비민감성 생장저해능에 필수적인 영역과 아미노산을 선별하기 위해서, 22℃ 조건에서 생장저해능을 나타냈던 돌연변이 과발현 형질전환체들을 28℃ 조건에서 배양하여 생장저해능을 조사하였다. 그 결과 AtTX12의 CΔ1 (1~193 a.a.)과 CΔ2 (1~183 a.a.)는 고온 조건에서도 생장저해능을 유지한 반면, CΔ3 (1~173 a.a.)는 고온 조건에서 생장저해능이 소실되었다. 또한, 22℃ 조건에서 생장저해능을 나타냈던 N36D (AtTX12) 돌연변이의 경우 고온 조건에서 활성을 소실하였다. 따라서 AtTX12가 고온 비민감성 생장저해능을 유지하기 위해서는 C-말단의 αE와 αF 사이에 존재하는 174~183 a.a.의 영역이 필수적이며, βB 상의 36번째 아스파라긴이 필수적이라는 것이 확인되었다. 한편, AtTX12에 의한 고온 비민감성 생장저해능이 ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1) 의존적인지 확인하고자 야생형 배경의 Q2610>>AtTX12 비해서 생장저해능이 크게 약화된 eds1-2 Q2610>>AtTX12 유식물을 22℃ 및 28℃ 조건에서 배양한 결과 이들은 두 조건에서 서로 대등한 생장저해 표현형을 나타냈다. 이러한 결과는 AtTX12에 의한 생장저해능은 1) EDS1-의존적 경로와 2) EDS1-비의존적 고온-비민감성 경로에 의해서 전달된다는 것을 제시한다. 따라서 eds1-2 Q2610>>AtTX12 과발현체 배경은 새로운 생장저해능 또는 병저항성 경로를 선별하기에 적합한 유전학적 배경으로 활용될 수 있다.