Anti-Bacterial and Anti-Inflammatory Effects of Osmin against Klebsiella pneumoniae

Abstract

The development of various types of antibiotics meant that human could be cured from numerous bacterial infections. However, antibiotic abuse has led to the widespread occurrence of antibiotic resistant bacteria which has developed resistance to existing antibiotics. The emergence of super bacteria, which are not susceptible to any currently available antibiotics, poses a major threat to human and public health, especially at a time of increasing human and logistical movement. Consequently, the appearance of super bacteria is not limited to a specific region of the world but is emerging as an international problem. Alternative antibiotic treatments are urgently needed and antimicrobial peptides (AMPs) have been attracting attention as potential alternatives to antibiotics. AMPs show a rapid mechanism of action, and broad antibacterial spectrum, in addition to anti-cancer and anti-inflammatory properties. Osmin is a peptide isolated from bee venom and is composed of 17 amino acid residues. Bee venom peptides have been shown to have excellent antibacterial and anti-inflammatory properties in previous studies. In this study, we confirmed the antibacterial and anti-inflammatory effects of Osmin. The peptide showed excellent antibacterial activity against a variety of strains, including antibiotic-resistant strains. It showed similar or improved antimicrobial activity as the control peptide (bee venom peptide, Melittin) against the antibiotic-resistant K. pneumoniae strains. The hemolytic activity of sheep red blood cells and cytotoxicity tests using HaCaT, MRC-5, and A549 cells confirmed that Osmin was less toxic than Melittin. In addition, the peptide effectively showed biofilm inhibition ability compared to Melittin. To confirm the bactericidal mechanism of Osmin, the secondary structure of the peptide was analyzed using circular dichroism. It was found that Osmin directly interacted with the bacterial membrane through an α-helical structure. Outer membrane permeability was performed using NPN and change in membrane potential was measured using DiSC3-5, in addition to bacterial membrane integrity using propidium iodide. It was confirmed that, like the control peptide, Melittin, the membranes of bacteria were rapidly destroyed by Osmin, contributed to the antimicrobial activity. Osmin was found to be relatively stable when compared to Melittin under various physiological salts, pH values, temperatures, proteases, and human serum. In addition, the peptide did not induce resistance until 30 passages in the drug resistance experiment. In an in vivo test, Osmin showed antimicrobial activity in mouse blood and tissues (lung, liver, spleen, and kidney) in a carbapenem-resistant K. pneumoniae-induced sepsis mouse model. Furthermore, a decrease in the expression of pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, IL-6, and TNF-α) in the mouse organs, indicated that Osmin had anti-inflammatory effect. These results indicate that Osmin can be developed as an alternative therapeutic agent for antibiotic-resistant K. pneumoniae strains. |여러 종류의 항생제 개발로 인류는 박테리아 감염으로부터 자유로워질 수 있었다. 하지만 항생제의 빈번한 사용과 오남용 문제로 인하여 박테리아는 기존의 항생제에 대한 내성 기작을 가지게 되었고 그 결과 어떠한 항생제로도 치료되지 않는 슈퍼 박테리아가 등장하게 되었다. 이러한 슈퍼박테리아의 출현은 인간의 건강과 공중보건을 위협하는 대상이 되었으며 전 세계적으로 인간과 물류 이동이 증가함에 따라 슈퍼 박테리아의 출현이 특정 지역 국가에만 국한되지 않고 전 세계적인 문제로 떠오르고 있다. 그러므로 이 문제를 해결할 수 있는 새로운 항생 대체 물질이 필요한 실정이며 그 대체물질 중 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)는 대안 중 하나로 주목받고 있다. 항균 펩타이드는 다양한 생명체에서 분리 · 정제될 수 있는 생체 방어 물질로 12-50개의 아미노산으로 구성되어 있는 작은 단백질로 정의된다. 항균 펩타이드의 대표적인 특징은 기존 항생제와는 다른 작용기전으로 광범위한 항균, 항진균, 항암, 항염증 효과 등이 있으며 항생제 대체물질 개발로 적합성을 인정받고 있다. 이전 연구에서 Osmin은 메이슨 꿀벌의 일종인 Osmia rufa의 독으로부터 분리되었으며 17개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 펩타이드로 확인되었다. 기존에 보고된 벌독 유래의 펩타이드들은 항균, 항 염증, 면역증강 효과가 탁월한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 논문에서는 Osmin의 항균 활성 기작과 항염증 효과에 대해 확인하였다. 그 결과로 Osmin은 다양한 그람 양성 및 그람 음성 균주뿐만 아니라 항생제 내성을 갖는 을지병원(29개의 균주) 과 아산병원(23개의 균주) 감염 내과의 환자로부터 분리된K. pneumoniae균주들에 대해 대조군 펩타이드로 사용된 벌독 유래 펩타이드 Melittin 과 같거나 더 좋은 항균 활성을 보였다. 그리고 인간 각질 형성 세포(HaCaT), 인간 폐 섬유아세포(MRC-5), 폐포 상피세포(A549) 그리고 적혈구를 이용한 펩타이드 독성을 평가한 결과에서Osmin은 Melittin 보다 독성이 적게 나타남을 확인하였다. 다음으로, Osmin의 생물막 억제 능력과 제거 능력을 확인한 결과 K. pneumoniae KCTC 2208과 카바페넴 계열 항생제에 내성을 갖는 K. pneumoniae (ASKP 1-5) 균주들에 대해서도 Osmin은 Melittin 보다 더 낮은 농도에서 효과적으로 생물막 생성을 억제하고 비슷한 생물막 제거 능력을 가졌다. Osmin의 박테리아를 사멸하는 기작은 원편광 이색성(Circular dichroism, CD) 측정장치를 통한 분석을 통해 박테리아 막을 모방한 용액과 펩타이드를 반응하여 펩타이드 이차구조를 확인하였다. 그 결과 Osmin은 α-나선구조의 이차구조를 가졌으며 이를 통해 정전기적 상호작용과 소수성 상호작용을 통해 박테리아 막과 직접적으로 작용하는 것을 알 수 있었다. 그리고 NPN(1-N-phenylnaphthylamine)을 이용한 박테리아의 외막 투과성, DiSC3-5(3,3’-Dipropylthiadicarbocyanine iodide)를 이용한 박테리아의 원형질막 전위 변화, PI(Propidium iodide)를 이용한 박테리아 막 손상에 대한 실험들을 진행하였으며 그 결과로 Osmin은 Melittin과 같은 기작으로 박테리아의 막을 표적으로 빠르게 파괴하여 항균 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 생체 외에서 펩타이드의 안정성을 확인해보기 위해 다양한 생리적 염 이온에서 박테리아의 항균 활성을 확인한 결과 1가, 2가 그리고 3가 이온 모두 Melittin과 같은 항균 활성을 보이거나 더 좋은 항균 활성을 보였으며, 광범위한 pH와 온도에서 펩타이드를 반응시켜 박테리아 억제 영역을 측정한 결과 Melittin보다 더 넓은 억제 영역을 보였고 다양한 pH 와 온도 환경에 대해 안정적인 항균 활성을 확인하였다. 그리고 인체 내에 존재하는 효소인 Pepsin, Trypsin, α-Chymotrypsin에 대해 펩타이드를 다양한 시간대에 반응시켜 항균 활성을 확인한 결과, Osmin은 특히 Trypsin과α-Chymotrypsin의 환경에서 24시간까지 항균 활성에 큰 변화 없이 유지되는 것을 확인하였다. 또한 인간 혈청과 펩타이드를 다양한 시간대에 반응시켜 항균 활성을 측정한 결과로 Osmin은 4시간까지 항균 활성이 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 Osmin은 다양한 환경 조건 속에서 안정성을 보였으며 Melittin 보다 상대적으로 더 좋은 안정성을 갖는 것을 보여준다. 약물 내성 분석 실험에서는 Osmin과 카바페넴 내성 균주의 치료 항생제인 Tigecycline을 이용하여 0.5× MIC로 연속 30계대 처리하여 박테리아의 내성 유발을 확인하였으며 Tigecycline은 30계대 후 평균 107 μM까지 내성이 증가하여 박테리아에 내성이 유발되었지만 Osmin은 처음 항균활성(2 μM)을 30 계대까지 유지함으로써 박테리아에 내성이 유도되지 않음을 확인하였다. 이로써 Osmin이 항생제와 달리 박테리아에 내성을 유도하지 않는 효과적인 치료제가 될 수 있음을 증명하였다. 마지막으로, 생체 내 실험에서 카바페넴 내성 K. pneumoniae 균주로 유도한 패혈증 마우스 모델에 대해 Osmin은 혈액과 조직(폐, 간, 비장, 신장)에서 효과적인 항균 활성을 보였으며 전염증성 사이토카인(IFN- γ, IL-6, TNF-α)들의 발현 억제를 보임으로써 항염증 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과들은 Osmin이 항생제 내성 K. pneumoniae균주 감염에 대한 효과적인 항생제 대체 치료제로 활용될 수 있다고 전망된다.