Antibacterial Activity and Mechanism of Action of Css54 and its Analog Peptides against Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii

Abstract

Acinetobacter baumannii is a major cause of nosocomial infections, and the increasing incidence and prevalence of multidrug-resistant A. baumannii (MDRAB) infections due to antibiotic abuse is a global public health concern. As the availability of antibiotics is limited, the development of new antibiotics is urgently required. Antimicrobial peptides (AMPs) with broad-spectrum antimicrobial activity are promising alternatives to antibiotics for the treatment of multidrug-resistant bacterial infections. In a previous study, Css54 was isolated from the venom of scorpion Centruroides suffuses suffuses. In the present study, analog peptides (Css54-A1, A2, A3, and A4) were designed based on Css54, by substituting alanine (A) and lysine (K) residues for phenylalanine to reduce cytotoxicity and truncating to reduce the length. The antibacterial activity of analog peptides against gram-positive and -negative bacteria and MDRAB was comparable to that of the parent peptide. Moreover, Css54 and its analog peptides effectively inhibited biofilm formation in MDRAB. The hemolytic activity and cytotoxicity to mammalian cells of analog peptides were lower than that of the parent peptide. Among the analog peptides, Css54-A3 showed the lowest toxicity. The secondary structure of analog peptides in bacterial membrane-mimetic environments revealed an α-helical structure. Calcein leakage from the membrane-mimicking liposomes showed that the analog peptide Css54-A3 did not affect erythrocytes and mammalian cell membranes but selectively acted on the gram-negative bacterial membrane. The NPN uptake assay, cytoplasmic membrane depolarization assay, and flow cytometry analysis revealed that all analog peptides disrupted the bacterial membrane and dissipated membrane potential. Among the analog peptides, Css54-A2, A3, and A4 had a lower effect on the bacterial membrane than Css54. DNA binding assay was performed to determine whether the peptides interacted with intracellular substances. Css54-A2, A3, and A4 were found to exhibit antibacterial action by binding to DNA. In addition, Css54-A2, A3, and A4 showed antibacterial activity by inducing intracellular reactive oxygen species generation. Moreover, unlike conventional antibiotics, the analog peptide Css54-A3 did not induce bacterial resistance. These results suggest that Css54-A3 is a promising therapeutic agent for combating MDRAB.|아시네토박터 바우마니균은 원내감염 및 기회감염을 일으키는 주요 원인 균주 중 하나로 항생제 남용으로 인한 다제내성 아시네토박터 바우마니균 감염증의 발생률 및 유병률 증가는 전 세계적인 공중 보건 문제가 되고 있다. 지속적인 항생제 개발에도 불구하고 사용 가능한 항생제 수가 제한되어 있으며, 내성을 가지는 균주들이 빠르게 증가하고 있어 새로운 항생제의 개발이 시급한 상황이다. 그에 따라 항생제를 대체할 수 있는 후보물질인 항균 펩타이드(AMPs)가 주목받고 있다. 항균 펩타이드는 광범위한 항균 활성을 가지며, 다제내성균 감염증 치료에 사용되어지는 항생제 대안으로서 유망한 치료제이다. 이전의 연구에서, 25개의 아미노산 잔기를 가지는 모체 펩타이드 Css54는 전갈 독에서 분리되었으며, 그람 양성 및 그람 음성균에 대해 높은 항균 활성을 보이는 반면 적혈구와 동물세포에서 강한 용혈현상 및 세포독성을 보였다. 본 연구에서는, 모체 펩타이드 Css54를 기반으로, 아미노산 잔기를 치환 및 절단하여 새로운 유사체 펩타이드를 설계하였다. 유사체 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균에 대해 모체 펩타이드와 유사한 항균 활성을 나타냈으며, 특히 아시네토박터 바우마니균에 대해 높은 항균 활성을 보였다. 또한, 다제내성 아시네토박터 바우마니균에 대해서도 뛰어난 항균 효과를 보였으며, 생물막 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 유사체 펩타이드는 모체 펩타이드Css54보다 적혈구 용혈활성 및 세포독성이 낮았으며, 그 중 Css54-A3이 가장 낮은 독성을 보였다. 원편광 이색성 분광법을 이용하여 박테리아 막 모방 환경에서 유사체 펩타이드의 2차 구조를 분석한 결과, 박테리아 막에 높은 결합 친화성을 보이는 알파 나선 구조를 가지는 것을 확인하였다. 또한, 인공적인 막 모방 리포좀에서의 칼세인 누출을 통해 적혈구 세포 및 포유동물 세포막에는 영향을 미치지 않으며, 그람 음성균의 막에만 선택적으로 작용함을 확인하였다. NPN 형광 염료를 이용한 외막 투과성 분석과 DiSC3(5)를 이용한 세포질막 탈분극 분석 및 PI를 이용한 유세포 분석을 통해 모든 유사체 펩타이드가 박테리아 막을 파괴하고 막 전위를 소산 시키는 것을 확인하였다. Css54-A2, A3와A4는 모체 펩타이드에 비해 박테리아 막에 미치는 영향이 낮은 것을 확인하였다. 위에서 언급한 세포막 메커니즘 이외에도 세포막이 아닌 세포 내 물질과 작용하는지 알아보기 위해 DNA 결합 분석을 한 결과 Css54-A2, A3와A4는 DNA와 결합함으로써 항균 작용을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, A2, A3와A4는 박테리아 내에서 활성산소 (ROS) 생성을 유도하여 항균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 유사체 펩타이드Css54-A3는 항생제와 달리 박테리아 내성을 유도하지 않았다. 이러한 결과들을 통해, Css54-A3는 항생제를 대체할 만한 치료제로써 활용가치가 있다고 전망된다.