Reversible function of RapA with the C-terminal region of RapC and development of rapC null cells in Dictyostelium

Abstract

Ras proteins are small GTPases involved in diverse signaling pathways including cell migration and differentiation. RapA is a key regulator of migration and cell adhesion in Dictyostelium. Recently it has been reported that loss of RapC, which is a Ras subfamily protein with the highest homology to RapA, resulted in severe defects in multicellular development and migration. Interestingly, these phenotypes of rapC null cells are similar to those of the cells expressing the constitutively activated form of RapA, suggesting that RapA and RapC might play opposite functions in cell spreading and cell migration. RapC has a unique long stretched C-terminus, which is not present in RapA and other Ras proteins, and it was postulated that the C-terminus of RapC might play some roles in the antagonistic effects of RapC to RapA. To determine the functions of the C-terminus of RapC, I examined if the phenotypes of rapC null cells were rescued by expressing full-length RapC or the C-terminus deleted RapC. Only the intact RapC were able to rescue the defects of rapC null cells. In addition, I examined whether the C-terminus of RapC plays a role in reversing the functions of RapA using a recombinant RapA fused with the C-terminus of RapC. Recombinant RapA fused with the C-terminus of RapC completely recovered the phenotypes of rapC null cells, indicating that the functions of RapA were modified to become similar to those of RapC by the C-terminus of RapC with respect to cell morphology, cell adhesion and migration, cytokinesis, and development. Dictyostelium cells feed on bacteria. When all the food is exhausted, the cells undergo developmental processes; Dictyostelium cells secrete chemoattractants to communicate with each other enabling them to form a multicellular aggregate. The aggregates transform to a motile slug which later culminates to a fruiting body with a dead stalk holding a mass of dormant spores. The previous study showed that RapC was required for proper development, and rapC null cells had developmental phenotypes forming multiple tips from a single mound and multi-branched developmental structures. To investigate the reasons for the developmental defects of cells lacking RapC, I determined if the cAMP signaling pathway and membrane potential are involved in development. Caffeine is known as an antagonist of adenosine and suppresses vibrating cAMP waves. When Dictyostelium cells were developed in the presence of caffeine, interestingly the developmental phenotypes, forming multiple tips, similar to those of rapC null cells were observed. These results suggest that the cAMP signaling pathway might be defective in rapC null cells causing the developmental phenotypes. To determine if the membrane potential is involved in development, I examined development at the various concentrations of potassium in the developmental media. There was no significant difference in development at high concentrations of potassium compared to wild-type cells. However, multi-tips were formed when the cells were applied with electric fields in the presence of high concentrations of potassium. Further studies should be followed for understanding the mechanism for multi-tip formation during development and the Ras signaling pathway.|Ras 단백질은 세포 이동 및 분화를 포함한 다양한 신호 전달 경로에 관여하는 작은 GTPase이다. RapA는 딕티오스텔리움에서 세포 부착 및 이동에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근 논문에서는 RapA와 가장 높은 상동성을 갖는 Ras 서브 패밀리 단백질 인 RapC의 손실이 발달 과정 및 이동에 심각한 결함을 초래한다는 것이 알려졌다. 흥미롭게도 이러한 rapC null 세포의 표현형은 RapA를 발현하는 세포의 표현형과 유사하며, 이는 RapA와 RapC가 세포 확산 및 세포 이동에서 반대 기능을 할 수 있음을 시사합니다. 또한 RapC는 다른 Rap 단백질에 존재하지 않는 고유 한 긴 C- 말단을 가지고 있다. RapC의 C-말단의 기능을 결정하기 위해, 우리는 RapC를 발현하여 rapC null 세포의 표현형이 야생형과 비교해보았고 또는 C- 말단이 RapC를 포함하지 않고 RapC에 Ras 도메인만 가지고 RapC에 기능을 하는지 알아보았다. 온전한 RapC만이 rapC null 세포의 결함을 보완할 수 있었다. 그리고 RapC의 C-말단이 RapA에 기능에 어떠한 영향이 있는지 확인하였을 때 RapA는 rapC null 세포의 결함을 보완하지 못 하였지만 RapC의 C-말단과 융합된 재조합 RapA는 RapC의 세포 형태, 이동, 발생에서 RapC와 유사한 기능을 하였다. 발생단계는 배 발생과 세포 이동에 중요한 메커니즘이다. 딕티오스텔리움은 모든 음식이 고갈되었을 때부터 발생단계를 거치게 된다. 발생단계가 시작될 때 딕티오스텔리움은 화학 유인물질을 분비하여 서로 소통하여 다세포 응집체를 형성한다. 응집체는 최종적으로 단일 마운드에서 하나의 tip를 형성하게 된다. 이전 연구에서는 RapC가 적절한 발달에 필요했으며 rapC null 세포는 단일 마운드 및 다중 분기 발달 구조에서 여러 팁을 형성하는 발달 표현형을 가지고 있음을 보여주었다. RapC가 결실 된 세포의 발달 결함에 대한 이유를 조사하기 위해 cAMP 신호 전달 경로와 막 잠재력이 발달에 관여하는지 확인했다. 카페인은 아데노신의 길항제로 알려져 있으며 진동하는 cAMP 파동을 억제한다. 카페인 존재 하에 야생형 세포가 개발되었을 때, 흥미롭게도 rapC null 세포와 유사한 여러 팁을 형성하는 발달 표현형이 관찰했다. 이러한 결과는 cAMP 신호 전달 경로가 발달 표현형을 일으키는 rapC null 세포에서 결함이 있을 수 있음을 시사한다. 막 잠재력이 발달에 관여하는지 확인하기 위해 나는 발달 매체에서 다양한 농도의 칼륨에서 발달을 조사했다. 야생형 세포와 비교하여 고농도의 칼륨에서 발달에 큰 차이가 없었다. 그러나 고농도의 칼륨이 존재 상태에서 세포에 전기장을 가하면 다중 팁이 형성되었다. 개발 중 다중 팁 형성 메커니즘과 Ras 신호 전달 경로를 이해하기 위해 추가 연구가 수행되어야 한다.