Opposite Functions of RapA and RapC and Roles of RasZ in Dictyosteilum

Abstract

Ras proteins, small GTPases, are major regulators of diverse signaling pathways including cell migration, adhesion, and development. 15 Ras proteins are found in Dictyostelium genome. Rap proteins among them play an important role in cell adhesion and cell migration. Recent studies suggested that RapA and RapC had an antagonistic effect on cell spreading, cell adhesion, and cell migration. Here, I investigated the opposite functions of RapA and RapC in cellular processes. First, I compared the phenotypes of RapA or RapC overexpressing cells in cell morphology, cell adhesion, cell migration, and development. RapA overexpressing cells exhibited highly spread morphology, strong adhesion and slow migration speed. In contrast, RapC overexpressing cells showed shrank and rounded morphology, weak adhesion and accelerated migration speed compared to wild-type cells, which are opposite phenotypes to RapA. rapC null cells showed similar phenotypes to RapA overexpressing cells, such as spread morphology, strong adhesion and slow migration speed. Reintroduction of RapC into rapC null cells rescued the phenotypes in cell morphology and cell adhesion. RapC appears to play a unique role in multicelluar developmental process. rapC null cells had a defect in development by forming the abnormal multiple tips from one mound. In this study, I confirmed that RapA and RapC have opposite functions in the regulation of the cell size, cell attachment to substrate, and cell migration during chemotaxis. In the domain structure, RapC has additional amino acids at the C-terminus, which are not found in RapA. The mechanisms for opposite functions of RapA and RapC in various cellular processes is required further to understand the Rap signaling pathways. Cell migration is essential for immune response, wound healing, and metastasis of cancer. The defects in cell migration are not only associated with cancer, but also with many other diseases such as rheumatism and osteoporosis. Ras proteins have been studied over 4 decades because of their crucial roles in human oncogenesis. It also has been known that Ras proteins play an important role in the regulation of cytoskeleton during cell migration. The Ras GTPase subfamily in Dictyostelium is consisted of 15 proteins; 11 Ras, 3 Rap, and one Rheb related protein. Rap1 has been the most studied of the Ras family because it is known as the antagonist of Ras protein. Rap1 plays important roles in integrin-mediated cell adhesion, cadherin-based cell-cell adhesion, and cell polarity in mammalian cells. In Dictyostelium, Rap1 is involved in controlling call adhesion, phagocytosis, and cell migration. Despite of the importance of Ras family in cellular processes, the functions of many Ras proteins remain unknown. Here I examined the roles of RasZ in morphogenesis, cell adhesion, cell migration, and multicellular development. Phylogenetic analysis showed that RasZ belongs to a group with RasX and RasW, showing 90% and 82% identities respectively. To investigate the roles of RasZ, I compared the phenotypes of wild-type cells, rasZ null cells, and rasZ null cells expressing RasZ. rasZ null cells showed small cell size and smooth cell surface, and having weak cell adhesion to the substratum, comparing with wild-type cells. Cells lacking RasZ also showed increased migration during chemotaxis and small size of spores and slightly elongated stalks during multicellular development. These phenotypes were rescued by expressing of RasZ. This study shows that RasZ plays an important role in diverse cellular processes including morphogenesis, cell adhesion, migration, and development in Dictyostelium. |작은 GTPase인 Ras 단백질은 세포 이동 및 부착 그리고 발생과정을 포함한 다양한 신호 전달 경로의 주요 조절자이다. 15개의 Ras 단백질이 딕티오스텔리움 게놈에서 밝혀졌다. Ras 단백질 중 Rap 단백질은 세포의 부착과 이동에 중요한 역할을 한다. 최근 연구결과에 따르면 RapA와 RapC가 세포 형태, 세포 부착력 그리고 세포 이동에서 상반된 기능을 보였다. 먼저, 과발현된 RapA와 RapC의 세포 형태, 세포 부착, 세포 이동 그리고 발생과정에서의 표현형을 비교하였다. 야생형 세포와 비교하였을 때, 과발현된 RapA 세포는 증가된 세포크기와 기질과의 강한 부착력을 보였으며 세포이동속도가 감소되었다. 반면, 과발현된 RapC 세포는 세포의 표면이 둥글며 줄어든 세포크기와 약한 부착력을 보였고 세포이동 속도가 증가되었다. rapC null 세포는 과발현된 RapA와 같이 증가된 세포형태, 강한 세포 부착력 그리고 느린 세포이동 속도를 보였다. RapC를 삽입한 rapC null세포는 rapC null세포가 가진 세포 크기와 부착력에 대한 결함을 보완하였다. 놀랍게도 다세포 발생 과정에서 RapC는 독특한 역할을 보였다. rapC null 세포는 한 개의 마운드에서 비정상적으로 여러 개의 자실체 줄기를 형성하는 결함이 있었다. 본 연구를 통해 딕티오스텔리움 내 RapA와 RapC가 세포 크기, 부착력 및 세포이동속도를 반대로 조절한다는 것을 확인했다. 도메인 구조에서 RapC는 RapA에서 찾을 수 없던 추가 아미노산 서열을 C말단에 보유했다. RapA와 RapC의 다양한 세포 과정에서 상반된 기능에 대한 메커니즘은 추후 Rap 신호전달을 이해하기위해 요구된다. 세포이동은 면역반응, 상처 치유, 그리고 암의 전이에 중요하다. 세포이동조절의 실패는 암뿐만 아니라, 골다공증, 생명현상 유지의 필수적인 현상이다. Ras 단백질은 사람의 종양 형성에 중요한 역할을 하기 때문에 지난 40년간 연구되어 왔다. 또한 Ras 단백질은 세포이동 동안 세포골격을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 딕티오스텔리움에서 Ras GTPase 아과는 11개의 Ras, 3개의 Rap, 그리고 1개의 Rheb 연관 단백질로 총 15개의 Ras 단백질로 구성되어 있다. Rap1은 Ras 단백질의 길항자로 잘 알려져 있기 때문에 Ras 과 중 가장 많이 연구되어 왔다. Rap1은 척추동물 세포에서 인테그린 연관 세포의 부착, 카드헤린 기반 세포들 간 부착, 그리고 세포의 분극화에 중요한 역할을 한다. 딕티오스텔리움에서 Rap1은 세포부착, 식세포작용, 그리고 세포이동의 조절을 담당한다. Ras 과 단백질의 중요성에도 불구하고 많은 Ras 단백질은 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 그러므로 딕티오스텔리움을 이용해 Ras 단백질인 RasZ의 세포형태, 세포부착, 세포 이동, 그리고 다세포 발생과정에 어떤 역할을 하는지 본 연구를 통하여 알아보고자 한다. 계통수 분석에서 RasZ는 RasX와 90%, RasW와 82%의 높은 상동성을 보였다. RasZ의 기능에 대해 알아보기 위해 야생형 세포, rasZ null 세포, 그리고 RasZ를 삽입한 rasZ null 세포의 표현형을 비교했다. rasZ null 세포는 야생형과 비교했을 때, 세포의 크기가 작았고 기질과의 약한 부착력을 보였으며, 주화성이동동안 증가된 세포이동속도를 보였다. 다세포 발생과정 동안, rasZ null 세포는 줄기의 길이가 길어졌으며 포자체의 크기가 감소했다. 이러한 표현형은 RasZ에 의해서 보완되었다. 연구를 통하여 RasZ가 딕티오스텔리움 내에서 세포의 형태와 기질과의 부착력 및 세포이동속도를 조절함을 확인하였다. 본 연구를 통해 딕티오스텔리움에서 RasZ가 세포형태, 기질과의 부착력 및 세포이동, 그리고 발생과정을 포함한 여러 세포 과정을 조절함을 확인했다.