Anti-Bacterial and Anti-Inflammatory Activity of dCATH Analogue Peptides in Infectious Pneumonia

Abstract

전 세계적으로 항생제가 개발되고 보급됨에 따라, 인간의 건강 및 수명은 근 십 여년 간 크게 개선되며 증가하였다. 하지만, 항생제를 쉽게 접하고 자주 사용함에 따라 항생제 내성 박테리아들이 발생하기 시작하였으며, 이는 인간의 건강을 다시 위협하고 있으며 새로운 치료제의 개발이 필요한 상황이다. 항생 펩타이드는 그 중 가장 주목을 끌고있는 치료제 후보물질 중 하나이다. 이전 연구에서 dCATH은 오리의 조류 Cathelicidin에서 발견되었다. 우리는 dCATH에 대한 18 (dCATH-A7), 20 (dCATH-A1–6)개의 아미노산 잔기로 이루어진 유사체 펩타이드를 설계하였다. dCATH의 체내에서의 독성을 줄이기 위해 양 순전하와 친수성 잔기인 알라닌과 라이신 잔기로 치환하였다. 게다가, dCATH-A6의 C 말단 아르기닌 잔기 2개를 잘라내었다. 그 결과, dCATH-A1–7은 모체 펩타이드와 비교하였을 때, 높은 순 전하와 양 친매성을 가지게 되었다. 또한, dCATH-A1–7은 다재내성 박테리아를 포함한 다양한 박테리아에서 모체 펩타이드보다 더 강한 항균 활성을 보였다. 뿐만 아니라, 모든 유사체 펩타이드는 모체 펩타이드에 비해 독성이 줄어들었으며, 항 바이오필름 활성 또한 모체에 비해 더 좋게 나타났다. 펩타이드들의 박테리아에 작용하는 기작을 확인하기위해 SYTOX green, depolarization assay, 그리고 flow cytometry analysis를 진행한 결과, dCATH-A1–5는 박테리아 막을 파괴하는 dCATH과 유사한 모습을 보였다. 이와는 다르게, dCATH-A6과 A7 펩타이드에서는 박테리아 막에 대해 약한 작용이 나타났다. DNA retardation assay에서 dCATH-A6과 A7 펩타이드는 DNA에 대한 작용을 보였다. 안정성을 확인하기위해 염 이온 환경에서의 항균 활성을 확인하였다. 그 결과, 염 이온 1가, 2가, 3가 모두에서 매우 안정적으로 나타났다. 게다가, 생체내 실험에서 dCATH-A6과 A7 펩타이드는 감영성 폐렴 쥐 모델에 대한 면역조절자로의 기능을 보였다. 이러한 모든 결과들은 새롭게 설계된 dCATH-A6과 A7펩타이드가 다재내성 균주에 의해 유발되는 감염성 폐렴에 대한 효과적인 치료물질이 될 수 있음을 나타낸다. |Recently, the number of multi-drug resistant (MDR) bacteria has been increasing rapidly, threatening human health. As the limitations of antibiotics have been widely documented, there is growing interest in developing new therapeutic agents, such as antimicrobial peptides (AMPs). In previous study, dCATH was identified in the avian cathelicidin of ducks. We designed 20- residues (dCATH-A1–6) and 18- residues (dCATH-A7) analog peptides. To reduce the toxicity of dCATH in vivo, we substituted dCATH with Lys and Ala which positive net charges and hydrophilic residues. In addition, we truncated two Arg of the C-terminal of the substituted dCATH, dCATH-A6. As a result, the analog peptides exhibited higher net charges and amphipathic than dCATH. dCATH-A1–7 showed strong antimicrobial activities against a wide variety of bacteria, including multidrug-resistant (MDR) bacteria than dCATH. In addition, all analog peptides appeared lower cytotoxicity and hemolytic activity than dCATH. Especially, dCATH-A6 and -A7 sho¬wed few cytotoxicity. These analog peptides displayed better anti-biofilm activity than dCATH. In a SYTOX green uptake assay, depolarization assay and flow cytometry analysis, dCATH-A1–5 showed a pattern similar to that of dCATH. But, dCATH-A6 and -A7 appeared to have a very weak effect on the bacterial membrane. In DNA retardation assay the dCATH-A6 and -A7 are penetrate the cytoplasmic membrane and interaction with DNA. At high concentrations of mono-, di-, and trivalent salts, the all analog peptides were very stable. In vivo, dCATH-A6 and -A7 showed a function as immunomodulators in infectious pneumonia mice model. These results suggest that the dCATH-A6 and -A7 are effective as therapeutic agents in infectious pneumonia caused by MDR.