Study of Biological and Immunomodulatory Activity of Antimicrobial Peptides against Human Pathogens

Abstract

의료 및 치료 용도로 항생제를 남용하면서 항생제 내성 병원균이 출현하게 되었다. 이로 인한 다중 약물 내성 박테리아에 의한 감염은 병원 및 사회 공동체에서 공중 보건 문제가 되고 있다. 특히 그람 음성 박테리아 감염의 항생제 치료는 박테리아를 둘러싼 장벽으로 기능하는 외부 막으로 인해 어렵다. 따라서 이런 외부장벽을 해체할 수 있는 항미생물 약제의 개발이 필요하다. 그람 음성균인 살모넬라는2,500 개의 혈청형을 갖는 것으로 알려져 있으며 높은 사망률로 인간과 동물에 모두 감염된다. 살모넬라증은 생명에 큰 위협이 되며 장티푸스, 패혈증, 장염 및 유산을 유발한다. 살모넬라 감염으로 인한 장티푸스로 인해 병으로 1,600 만 명이 감염되고 매년 60,000 명이 사망한다고 알려져 있다. 장티푸스로 인한 사망률은 2~3%으로 무시할 수 없을 정도의 수치이다. 다제내성 살모넬라의 증식은 암피실린, 트리메토프림-설파메톡사졸, 클로람페니콜 및 스트렙토마이신과 같은 상용화된 항생제의 사용에도 불구하고 제거하기 어렵기 때문에 주요한 사회적 문제가 되었다. 현재, 2세대 플루오로퀴놀론인 시프로플록사신에 대한 살모넬라의 내성이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 이와 같은 상황에서, 시프로플록사신은 여전히 살모넬라균의 치료용 항생제로 판매되고 있다. 또한, 살모넬라균은 가공된 음식으로부터 감염될 수 있으며, 더구나 항생제 내성 살모넬라의 문제는 축산업 과정에서 전 세계적으로 항생제 사용이 증가하는 상황에서 매우 심각해지고 있다. 따라서 살모넬라에 대한 감염을 예방하기 위한 공중 보건의 발달은 매우 중요하다. 이 대안으로, 항생 펩타이드 (AMP; Antimicrobial peptide)는 유망한 후보이며, 이는 다양한 동물, 식물, 및 곤충 종에서 유래된 숙주 방어 분자이다. 이들은 박테리아 막과의 상호 작용을 용이하게 하기 위해 양이온성 및 소수성 표면으로 구성된 구조적으로 분류된 양친매성 펩타이드이다. 결과적으로, 대부분의 항생 펩타이드는 그람 음성 박테리아 외부 막과 결합하기 위해 양이온성 및 소수성을 가지고 있다. 이 연구에서 Pinus densiflora에서 분리된 PN5는 광범위한 항균 및 항염증 활성을 나타낸다. 우리는 펩타이드가 이들 박테리아의 성장을 억제하는 메커니즘 및 다제내성 살모넬라 균주에 대한 항균 및 항염증 활성에 대해 연구하였다. 살모넬라 감염에 관여하는 면역 체계를 확인하기 위해, 항생 펩타이드 PN5를 처리하여 항염증 신호를 분석하였다. 생체 내 PN5의 효과를 확인하기 위해C57BL/6J에 살모넬라균을 복막에 감염시키고 PN5를 복막에 주입하여 조직학적 및 병리학적 징후를 살펴보았다. 이로써, 우리는 본 연구에서 PN5의 살모넬라에 대한 항균활성, 동물실험에서의 항염증 효과를 증명하였다. PN5는 이 결과들을 토대로 항생제 대체제 및 면역조절제로서의 이용이 가능할 것으로 판단된다.

항생제 내성 문제는 전 세계적으로 계속 커지고 있다. 1928년 페니실린에서 시작된 항생제의 역사는 항생제 내성 박테리아의 발달로 점차 부작용이 증가하고 있다. Acinetobacter baumannii는 항생제 내성으로 인해 심각한 병원균으로 부상되고 있다. A. baumannii는 세계 보건기구 (WHO) 가 지정한 ESKAPE 유기체 중 하나이며, ESKAPE유기체는 반코마이신 내성 Enterococcus faecium (VRE), 메티실린 내성 Staphylococcus aureus (MRSA), 다제내성 Klebsiella pneumoniae (ESBL 혹은 CBP 생성 균주), 카바페넴 내성 Acinetobacter baumannii (CRAB), 카바페넴 내성 Pseudomonas aeruginosa, 다제내성 Enterobacteriae (E. coli 등) 을 일컫는다. 이들은 임상적으로 심각하게 문제가 되고 있으며 카바페넴 내성 박테리아의 경우, 항생제 내성 효소 (NDM-1), 포린 또는 유출 펌프의 생성 및 세포막의 투과성 결함으로 인해 위험한 요소를 가지고 있다. 특히, A. baumannii는 병원에서 감염되는 경로로 인해 위험한 병원체로 알려져 있다. 또한 병원에서 A. baumannii에 감염된 환자 중에서는 74%가A. baumannii의 생물막 (Biofilm) 이 형성된 의료 기기로부터 감염이 보고되고 있다. 따라서 A. baumannii의 항생제 내성과 생물막은 전 세계적으로 해결해야 할 중요한 문제이다. 항생 펩타이드 (Antimicrobial peptide)는 항생제 내성과 바이오 필름과 같은 문제를 해결하기 위해 항생제 대체제로서 대두되고 있다. 항생 펩타이드는 12~50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. 다양한 유기체에서 유래하며 항균, 항염증 및 항암 효과가 있는 것으로 보고되었다. 항생 펩타이드는 항생제보다 내성을 덜 유발 시키기 때문에 항생제 내성 박테리아로 인한 문제를 해결하기 위한 훌륭한 대안이 될 수 있다. 본 논문에서 항생 펩타이드 PN5-CT-FL은 Pinus densiflora에서 유래 한 PN5의 C- 말단의 F 및 L 아미노산 잔기를 잘라 합성된 최소 아미노산 잔기로 항균활성을 갖는 펩타이드이다. 다제내성 A. baumannii균주는 카바페넴 항생제 메로페넴, 세프타지딤 및 세포탁심에 내성인 박테리아이며, PN5-CT-FL은 이 다제내성 A. baumannii균주에 대해 항균 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 모체 펩타이드 PN5와 유사하게 독성 및 용혈현상이 나타나지 않았다. 또한, NPN, DiSC3-5및 SYTOX Green을 사용하여 A. baumannii균주의 작용 메커니즘을 확인하였다. 이어서, 인공막을 칼세인이 로딩된 리포좀 상에서 PN5-CT-FL과 반응시켜 선택적 막 투과성을 조사하였다. PN5-CT-FL이DNA 및 RNA에 결합하는 능력을 측정하고, 그람 음성 박테리아의 외막 성분의 LPS에 대한 결합 및 중화 효과를 확인하였다. 결과적으로 본 연구는 항생제 대체제로서, PN5-CT-FL의 다제내성 A. baumannii에 대한 항균 효과와 작용기전을 검증하였으며 PN5-CT-FL은 유망한 새로운 항 미생물제로 활용하고자 한다.

사람의 장에는 수많은 장내 미생물이 있다. 장내 미생물의 수는 성인 기준 1kg이상의 장내세균이 존재한다고 추측되며 1013 내지 1014 범위의 다양한 장내세균이 공생하며 존재하고 있다. 장은 수많은 장내세균의 생태계를 지탱하고 장내 유익균과 유해균의 적절한 균형으로 면역 항상성을 유지하는 기관이며 장내 미생물은 다양한 미생물이 집중되어 숙주의 면역과 관련된 다양한 질병 및 장애에 영향을 미치는 커뮤니티이다. 장내 미생물은 인간 유기체의 자율 신경계와 상호 작용하여 뇌에 양방향으로 영향을 미치는 장-뇌 축을 구성한다. 부교감 신경의 미주 신경은 모든 유기체의 장에 분포되어있어 뇌의 기능에 영향을 미친다. 또한, 장내 장벽이 약해짐에 따라 장내 유해균의 증가와 장내세균 불균형이 장 누출을 일으켜 혈류 감염, 병독성 인자 및 혈액 내 순환하는 유해균으로 인한 사이토카인이 발생한다. 결과적으로, 전염증성 사이토카인에 의한 염증 및 혈-뇌 장벽으로의 독성인자가 유도된다. 이러한 장-뇌 신호 메커니즘으로 인해, 장-뇌 축은 인간 유기체의 정서적 및 인지적 과정 및 신경계를 담당하는 중요한 기초가 된다. 장-뇌 축에 긍정적인 결과를 주는 Bifidobacterium, Lactobacillus 계열의 유익균은 현재 연구계에서 큰 관심을 받고 있다. 그람 양성 박테리아 Bifidobacterium 와 Lactobacillus 는 염증성 사이토카인을 유발하는 지질 다당류 사슬이 없기 때문에 장 면역계에 불균형이 일으키지 않는다. Bifidobacterium 와 Lactobacillus 프로바이오틱은 또한 항염증성 사이토카인 IL-10 및 BDNF 신호 전달을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 뇌유래신경영양인자를 조절하는 유익한 박테리아이다. 그러나, 모든 그람 양성 박테리아가 Bifidobacterium 와 Lactobacillus 같은 장-뇌 축에 긍정적인 영향을 미치는 것은 아니다. 그람 양성 박테리아 중에서 Bacillus cereus, Enterococcus faecalis 및 Listeria monocytogenes와 같은 식품 매개 질병 발생을 유발하는 장 독소를 생성하는 박테리아는 장내 유해균으로 분류된다. Bacillus cereus, Enteroccocus faecalis 및 Listeria monocytogenes는 혈액을 감염시키고 혈류 감염을 통해 질병을 일으키는 혈액 매개 박테리아이기 때문에 혈-뇌 장벽을 손상시킬 수 있는 박테리아이다. 항생제는 주로 장내 유해균을 제거하기 위해 처방되지만 항생제는 항생제 내성균을 발생시키는 부작용을 유발한다. 항생제는 장에서 해로운 박테리아뿐만 아니라 유익한 박테리아도 죽이며 결국 장내세균의 불균형을 초래한다. 따라서 항생제는 장의 불균형을 치료하는 최선의 약물이 아니다. 항생제를 대체 할 수 있는 또 다른 항균제는 항생 펩타이드이다. 항생 펩타이드는 이전 연구에서 항생제를 대체 할 수 있는 항균제로 각광을 받고 있다. 항생 펩타이드는 최소 11 개에서 최대 50 개의 아미노산으로 구성되며 다양한 유기체에서 유래한다. 항생 펩타이드는 숙주 선천 면역에 반응하고 면역 조절의 일부인 숙주 방어 펩타이드라 불리기도 한다. 항생 펩타이드는 일부 연구에서 항균성, 항염증성 및 항암 효과와 같은 다양한 기능을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 항생제와 달리 박테리아에 대한 내성이 적다고 보고되고 있다. 이 연구에서 항생 펩타이드와 항생제를 장내 유익균과 유해균에 처리하여 장내 유해균에만 선택적으로 활성을 나타냈다. 장내 유해균의 혈류 감염에 대한 PMAP23 및 PMAP23-F 의 활성 안정성이 확인되었으며, PMAP23, PMAP23-F 및 PMAP23-K가 Bacillus cereus 의 병독성 인자를 조절할 수 있는지 여부를 결정하였다. Caco-2 세포에 유산균 Lactobacillus gasseri 및 장내 독소 생성균 Bacillus cereus 를 처리함으로써 ZO-1, ZO-2, claudin-1, and occludin과 같은 접합 단백질 (Tight junction) 신호 전달을 확인하였다. 장-뇌 축의 시험 관내 실험 모델을 구축하기 위해 Caco-2 상층액으로 조건화된 배지를 제조하였다. 조건화된 배지를 처리하여 SH-SY5Y에서 p65 (NF-κB), BDNF, CREB 및 mTOR 신호 전달을 확인하였다. 동물실험에서 장내 미주 신경에 유해균을 처리함에 따라 혈액-뇌 장벽을 손상시킬 수 있는 동물 모델을 만들었으며 이 모델에 PMAP23-F를 처리함에 따라 혈액-뇌 장벽 손상을 억제시킬 수 있는지 확인하였다. 따라서, PMAP23 및 PMAP23-F는 항생제를 대체할 수 있는 새로운 항균제이며, PMAP23-F는 장 생태계의 균형을 유지하면서 장내 유해균 감염 시 발생할 수 있는 신경퇴행성 및 뇌 질환을 치료할 수 있는 치료제로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.|The development of new antibiotics is necessary due to the increase of resistant strains from abuse of antibiotics. AMPs (antimicrobial peptides) have been proposed as a new antimicrobial agent to replace antibiotics. AMPs have been reported to play several roles, such as anti-fungi, anti-bacteria, anti-inflammation, and anti-cancer. The diversity and efficacy of AMPs makes them attractive target that can be applied to various aspects of disease. In this study, we examined the anti-microbial, anti-inflammatory, and in vivo effects in bacterial infection model of AMPs. In part 1, PN5 derived from pine needle (Pinus densiflora) showed antimicrobial effects against multi drug-resistant (MDR) Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa. In addition, the antimicrobial effect of PN5 against S. Typhimurium was maintained at various pH and temperatures. When S. Typhimurium was infected on RAW 264.7 cell, inflammatory signals such as NF-κB and MAPK signals were inhibited by PN5. We employed mouse model by intraperitoneal injection with S. Typhimurium. PN5 reduced bacterial numbers and recruitment of neutrophil in peritoneal fluid. We evaluated histology of spleen, liver, lung and colon which are inflamed on. The spleen exhibited disorganization of pulp compartments, the hemorrhage occurred in liver and invasion of neutrophil, macrophage was observed in lung and colon. The inflammatory responses were significantly decreased with PN5 treatment. These results suggested that PN5 could be a promising agent for S. Typhimurium infection. In part 2, we confirmed that the antimicrobial, anti-biofilm activity and mechanisms of short sequence PN5-CT-FL truncated from PN5. PN5-CT-FL was examined for antimicrobial effects and mechanisms for MDR A. baumannii clinically isolated from patients in Eulji Medical Center. PN5-CT-FL effectively inhibited biofilm formed by A. baumannii compared to ceftazidime, cefotaxime and meropenem used as controls. The mode of action of PN5-CT-FL was examined against A. baumannii using NPN uptake, DiSC3-5, SYTOX green and calcein leakage. PN5-CT-FL less affected membrane activity compared to that of the parental peptide PN5. However, we confirmed that the affinity for binding to plasmid DNA or A. baumannii RNA. It was evaluated that the affinity of DNA and RNA with PN5-CT-FL was increased using gel retardation assay. These results suggest that PN5-CT-FL could be an antimicrobial agent that replaces the antibiotics against MDR A. baumannii. In part 3, gut-brain axis is composed of bidirectional communication between the central nervous system and the enteric nervous system, and plays a role in determining the cognitive and emotional functions of the brain. In gut-brain axis, gut microbiome regulates the host immunity and maintains homeostasis by balancing harmful bacteria and beneficial bacteria in the gut. The use of antibiotics has been reported as cause of disturbing the balance of gut microbiome, whereas the selective activity of AMPs is expected to maintain the gut ecosystem with the balance of gut microbiome. We evaluated selective activity of PMAP23 and its analogs against gut bacteria. PMAP23 is a host defense peptide derived from porcine. PMAP23-F eliminates phenylalanine from PMAP23, reducing toxicity and increasing antimicrobial activity. We found that PMAP23 and PMAP23-F have antibacterial activity to selectively suppress growth of gut harmful bacteria such as Bacillus cereus, Listeria monocytogenes and Enterococcus faecalis without killing gut beneficial bacteria such as Lactobacillus gasseri and L. plantarum. Gram-positive bacteria as B. cereus, has lipoteichoic acid (LTA) in their outer membrane. We tested the ability of PMAP23-F to neutralize LTA and assessed the effect of PMAP23-F on TLR2 activation by B. cereus LTA. The expression of TLR2 stimulated by B. cereus LTA was inhibited by PMAP23-F treatment. B. cereus virulence factors as plcR, plcA and entFM which hydrolyzes eukaryotic membrane were investigated that PMAP23-F effectively suppressed the plcR, plcA and entFM. In Caco-2 cell, B. cereus reduced the expression of tight junction (TJ) proteins, PMAP23 and PMAP23-F prevent the reduction of TJ proteins by B. cereus. The Caco-2 supernatant was treated with SH-SY5Y cells to establish the gut-brain axis model in vitro, and the expression of BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) and CREB (cAMP-response element binding protein) mediating neurotrophic responses were analyzed in SH-SY5Y cell. In vivo, the gut-brain axis model of the central nervous system along the enteric nervous system was reproduced through the intestinal vagus nerve infected with L. gasseri and B. cereus. In this study, we confirmed that PMAP23-F has neuroprotective effect through gut-brain axis by regulating the balance of gut microbiome. Taken together, the potential of AMPs for antibiotic substitute against antibiotic-resistant bacteria and the role of AMP is identified of anti-inflammatory and immunomodulatory effects in vivo.