Protoplast Technology in Brown Algae (Phaeophyceae): Studies on Protoplast Isolation, Culture and Regeneration of 7 Brown Algal Species

Abstract

Protoplast technology uses protoplasts (e.g. cells whose cell wall has been removed by enzymatic digestion) as powerful experimental material for in vitro manipulations and crop improvement. This technology encompasses two main components: 1) protoplast isolation; and 2) protoplast culture and regeneration. Brown algae are a group of, mostly marine, photosynthetic organisms that are used in food, animal feed, traditional medicine, alginate industry, cosmetics and for pharmaceutical applications. Despite their high economic importance, protoplast technology in brown algae lags far behind that of other multicellular algae (e.g. green and red algae) and higher plants. Also, most protocols rely on crude extracts or non-commercial enzymes for producing protoplasts, which are expensive, time consuming and/or low reproducible. Thus, protocols with commercial enzymes are needed for properly establishing protoplast technology in brown algae. In this study, I selected 7 brown algal species (Dictyopteris pacifica, Ecklonia cava, Hecatonema terminale, Petalonia fascia, Scytosiphon lomentaria, Sphacelaria fusca and Undaria pinnatifida) and developed protoplast isolation protocols for them using only commercial enzymes. Among these species, the economic brown alga U. pinnatifida and other 3 (H. terminale, P. fascia and Sp. fusca) were selected for protoplast culture. In U. pinnatifida, I further explored the effect of light-emitting diodes (LED) on protoplast regeneration from the microscopic gametophytes and macroscopic sporophytes. Finally, I tested the potential of protoplast-derived aposporous filaments (PDAFs) for clonal propagation of U. pinnatifida sporophyte. In all the species, high amount of protoplasts were obtained using a simple mixture of commercial enzymes (cellulase RS and alginate lyase). Protoplasts yields ranged from 104-105 protoplasts g-1 fresh weight (FW) in the filamentous forms H. terminale and Sp. fusca, to 106-107 protoplasts g-1 FW in more complex brown algae (D. pacifica, E. cava, P. fascia, S. lomentaria and U. pinnatifida). Dictyopteris pacifica, E. cava, H. terminale and Sp. fusca represented new reports for protoplast production. The most important factors during isolation were growth, chelation pre-treatment, pH and osmolarity. Successful regeneration was achieved, for first time, in H. terminale, P. fascia and Sp. fusca. In U. pinnatifida, an improved method for protoplast culture and regeneration was developed. Critical conditions during this step were regeneration medium, initial protoplast density, antibiotics, light exposure, starting time of osmolarity reduction, and temperature. LED experiments in U. pinnatifida showed that dichromatic light (red plus blue, 1:2) enhanced protoplast regeneration and growth from filamentous gametophytes, and incremented the formation of normal sporophytes from PDAFs. In green LED, PDAFs could be propagated without formation of sporophytes while keeping a high potential for producing them upon dichromatic light exposure. Subculturing PDAFs with subsequent 6 weeks of re-growth could sustain sporophyte production over time. Regenerated sporophytes were diploid and showed identical genotype with the mother PDAF culture. This suggests that PDAFs could be used for sustained clonal propagation of U. pinnatifida sporophyte, opening a new possibility of protoplasts uses in brown algae. |원형질체 기술은 원형질체(세포벽을 제거시킨 세포)를 in vitro 조작이나 작물개선을 위한 유용한 실험재료로 사용한다. 이 기술은 크게 2가지 즉 1) 원형질체 분리, 2) 원형질체 배양 및 재생으로 구성되어 있다. 갈조류는 식품, 동물사료, 전통의학, 해조류 산업, 화장품 및 제약 분양에서 널리 사용되는 해양 광합성 조류이다. 이런 경제적 중요성에도 불구하고, 갈조류의 원형질체 기술은 다른 다세포조류(녹조류, 홍조류) 및 고등식물에 비해 개발이 늦어지고 있다. 또한 알려진 방법들은 비상업적 효소나 미정제추출물을 사용하여 비싸고 시간이 오래 걸리거나 그 생산량 또한 적다. 따라서, 갈조류에 원형질체 기술을 확립하려면, 상업적 효소를 사용한 원형질체 생산량이 높은 방법이 필요하다. 본 연구에서 7종(Dictyopteris pacifica, Ecklonia cava, Hecatonema terminale, Petalonia fascia, Scytosiphon lomentaria, Sphacelaria fusca, Undaria pinnatifida)의 갈조류를 대상으로 상업적인 효소들을 사용한 각종의 원형질체 분리방법을 개발했다. 원형질체 분리방법이 성공한 이들 종들 중 경제적으로 중요한U. pinnatifida 외3종(H. terminale, P. fascia, Sp. fusca )을 대상으로 원형질체 배양을 진행하였다. Undaria pinnatifida의 배우체와 포자체로부터 분리한 원형질체를 대상으로 생에서 LED의 효과를 연구하였다. 또한 U. pinnatifida 포자체의 클론 증식으로 나온 PDAFs (protoplast-derived aposporous filaments)의 재생 가능성을 연구하였다. 갈조류 7종에서 상업적 효소(cellulase RS and alginate lyase)의 간단한 혼합으로 확보한 원형질체 수율은 사상체 형태인 H. terminale과 Sp. fusca에서는 104-105 protoplasts g-1 fresh weight (FW) 이고, 좀더 복잡한 구조를 가진 갈조류 (D. pacifica, E. cava, P. fascia, S. lomentaria, U. pinnatifida)에서는 106-107 protoplasts g-1 FW이었다. 이들 중D. pacifica, E. cava, H. terminale과 S. fusca의 원형질체를 분리는 본 연구를 통해 처음으로 보고되는 것이다. 원형질 분리에 있어서 가장 중요한 요소는 growth, chelation 전 처리, pH과 삼투압이었다. 또한 본연구를 통해 처음으로H. terminale, Sp. fusca과 P. fascia에서 성공적인 원형질체의 재생이 이루어졌다. 그리고U. pinnatifida의 원형질체 배양 및 재생에서는 좀더 개선된 방법들이 개발되었고 이 단계에서 중요한 조건들은 재생 배지, 초기 원형질체 밀도, 항생제, 빛 노출, 삼투압 감소 시작 시간 및 온도로 파악되었다. Undaria pinnatifida 의LED 실험은 두 색의 조합(red plus blue, 1:2)이 사상형의 배우자체에서 원형질체 재생 및 성장을 강화할 뿐만 아니라, 포자체의 원형질체로부터 발달한PDAF가 정상적인 포자체로 재생되는 비율을 증가시켰다. 녹색 LED는 PDAFs가 포자체로 발달을 억제하고, 두 색의 조합(red plus blue, 1:2)은 포자체로 발달을 촉진시키는 것으로 나타났다. PDAFs는 6주 성장 후 계대배양을 지속하면, 포자체로 발달을 유지할 수 있었다. PDAF로부터 재생된 포자체는 이배체였으며, PDAF의 모체와 동일한 유전자형을 보였다. 이 결과는 원형질체에서부터 유래한PDAF가 U. pinnatifida의 지속적인 클론증식에 사용될 있는 가능성을 보여주었으며, 갈조류에서 원형질체를 활용한 대량생산의 새로운 길을 열어줄 것이라 기대된다.