Cloning and characterization of a recombinant metalloprotease rvFMP as a thrombolytic enzyme in human plasma and rat thrombosis models

Abstract

Cardiovascular diseases are the number one cause of death worldwide, which can be mainly induced by the fibrin deposits remained in arteries. Although several enzymes, including urokinase (uPA), streptokinase, and tissue-type plasminogen activator (tPA) are currently being used for a thrombolytic medication, they are all indirect enzymes activating plasminogen to plasmin that actually cleaves fibrin clots deposited in a blood vessel. However, the plasminogen activators show side effects such as bleeding, low blood pressure, nausea, and allergic reactions. This study was performed to develop a novel recombinant thrombolytic enzyme that can directly digest fibrin clots from Vibrio furnissii , a free-living marine bacterium that can be associated with gastroenteritis and skin lesions. There has been no report on extracellular protease(s) from V. furnissii in terms of developing a thrombolytic agent. This bacterium produces an extracellular 44 kDa metalloprotease named vFMP (stands for V. furnissii metalloprotease) as found by this laboratory. In this study, a vFMP-encoding gene was cloned from the genomic DNA of V. furnissii strain KCCM41679 using polymerase chain reaction (PCR) and expressed in Escherichia coli, from which a recombinant vFMP (named rvFMP; stands for recombinant V. furnissii metalloprotease) was purified and characterized. The sequencing data (deposited in the GenBank database under an accession number MG954380) showed that the vFMP-encoding gene contains an open reading frame (ORF) composed of 1,827 nucleotides, which can encode 608 amino acids with a predicted molecular mass of 67443.71 Da. The start and stop codons of the cloned gene were found to be ATG and TAA, respectively. When the deduced amino acid sequence of the cloned gene was compared with those of five other Vibrio-derived proteases from V. fluvialis (WP_020431607.1), Vibrio sp. RC586 (EEY99547.1), V. anguillarum (AAM15681.1), V. mimicus (BAG30958.1), and V. vulnificus (ALM73800.1) (number in parenthesis indicates GenBank accession number), there was an average of approximately 80.8% sequence similarity between their mature peptide regions. These results suggest that they are highly conserved proteases. The sequence comparison data also showed that the cloned gene can produce a prepro-rvFMP composed of 608 amino acids, which is organized with a signal peptide (24 amino acids), an N-terminal propeptide (173 amino acids), and a catalytic domain (411 amino acids) containing a typical Zn2+-binding motif (HEXXHG-X18-E) that is often found from other bacterial metalloproteases. The recombinant vFMP enzyme (rvFMP) expressed in E. coli was purified using two anion chromatographic steps employing HiTrap Q FF and Source 15 Q 4.6/100 PE columns and an additional size exclusion chromatography with Superdex 75 10/300 GL gel in order. The molecular masses of the purified enzymes were found to be approximately 44 kDa (processed form) and 39 kDa (truncated form) as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The optimal pH and temperature for the rvFMP activity were found to be 7.0 and 50°C, respectively, when azocasein was used as a substrate. The proteolytic activity of rvFMP could be inhibited by typical metalloprotease inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 1,10-phenanthroline (1,10-PT), but not by serine protease inhibitors, including phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and diisopropyl fluorophosphate (DFP). These results suggest that rvFMP is a typical metalloprotease. The purified protease was able to cleave various plasma proteins, including BSA, fibrinogen, prothrombin, collagen type IV, and plasminogen. The putative proteolytic cleavage site of rvFMP was a peptide bond located in the amino side of valine, as judged by N-terminal sequencing with two-digests of fibrinogen. The rvFMP enzyme showed fibrinogenolytic and fibrinolytic activities, as determined by in vitro cleavage assay. rvFMP could cleave all chains of fibrinogen, in which the Aα and Bβ chains could be digested completely within 1 min with a mass ratio of 1:7.9 (enzyme vs fibrinogen). The turbidity assay also showed that the relative turbidity of the fibrin polymer was decreased with plasmin (used as a positive control) or rvFMP treatment in a time-dependent manner. These results suggest that rvFMP has an enzyme activity to digest fibrin polymer actively. In addition, rvFMP could cleave cross-linked fibrin (XL-fibrin), as shown by SDS-PAGE and fibrin plate assay. In particular, plasmin (2 μg) and rvFMP (2 μg) could form clear halo-zones with diameters of 0.7 cm and 1.1cm, respectively, on fibrin plate. These results suggest that rvFMP has a clear XL-fibrin cleavage activity, approximately 2.5 times stronger than the same amount of plasmin in vitro. In this study, the in vivo anti-thrombotic effect of rvFMP on vascular thrombosis induced by FeCl3 exposure in rat carotid artery or kappa-carrageenan treatment in rat tail was also examined. Phosphate buffered saline (PBS), uPA (5.24 mg/kg), or rvFMP alone (100 µg/kg) showed no effect on the induction of the thrombus formation in the rat carotid artery, whereas the exposure of FeCl3 resulted in an extensive arterial thrombosis as expected. However, the formation of thrombi by the exposure of FeCl3 could be clearly reduced in a dose-dependent manner, when various doses of rvFMP (10-100 µg/kg) were pre-injected. This anti-thrombotic activity of rvFMP was also confirmed with the kappa-carrageenan-induced rat tail thrombosis model. The formation of vascular thrombi caused by 4 mg/kg of the carrageenan was clearly and dose-dependently decreased by the administration of uPA (5.24 mg/kg) or various concentrations of rvFMP (25-100 µg/kg). All these results suggest that rvFMP can digest effectively vascular thrombi in vivo. It was also revealed that rvFMP (1.5 mg/kg) evokes no internal bleeding and plasma fibrinogen depletion significantly, with no lethal effect on mice. In addition, the recombinant enzyme also showed no cytotoxicity and could not evoke the production of a typical inflammatory cytokine, tumour necrosis factor-α (TNF-α) in Raw 264.7 cells. Taken together, all these results demonstrate that rvFMP can be a candidate protease capable of being developed as a novel direct-acting thrombolytic agent.|심혈관계 질환은 전 세계적으로 주요 사망원인 중 하나이며, 주로 동맥에 남아있는 피브린 침착물(fibrin clot)에 의해 유발될 수 있다. 현재 urokinase(uPA), streptokinase 및 tissue-type plasminogen activator(tPA)와 같은 효소들이 혈전 용해제로 임상에서 사용되고 있지만, 이들 모두는 plasminogen을 plasmin으로 활성화시켜 혈관 내의 혈전을 분해하게 하는 간접작용 효소이며, 이들은 종종 출혈, 저혈압, 메스꺼움 및 알레르기 반응과 같은 부작용을 동반한다. 본 연구는 혈관 내 혈전에 직접 작용하여 분해함으로써 부작용이 적은 새로운 혈전 용해효소를 개발하고자 수행되었다. 본 연구에 사용된 Vibrio furnissii균은 위장염 및 피부병변을 일으킬 수 있는 해양세균이며, 전체 유전체서열은 2011년에 결정된 바 있다. 이 미생물은 자외선 차단을 위한 피부 관리, 항생제 대체재, 식품 보존제 등의 활성 성분으로 사용할 수 있는 엑토인, 박테리오신 등, 다양한 2차 대사물을 생산한다. 일반적으로 여러 종류의 비브리오 균주는 피브리노겐(fibrinogen)과 피브린(fibrin)을 분해 할 수 있는 다양한 종류의 단백질분해효소(protease)를 분비하는 것으로 알려져 있다. 그러나 혈전분해제 개발 측면에서 V. furnissii에서 생성되는 분비성 단백질분해효소에 대한 연구는 전무하다. 본 연구실에서는 V. furnissii는 vFMP(V. furnissii metalloprotease의 약자)라 명명한 44 kDa 크기의 metalloprotease를 분비한다는 사실을 밝혀낸 바 있다. 본 연구에서는 V. furnissii KCCM41679 균주의 유전체 DNA로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 vFMP 유전자를 클로닝한 후, 대장균에서 발현시켜 재조합 단백질분해효소를 분리ㆍ정제하였으며 이를 rvFMP(recombinant vFMP)라 명명하였다. 클로닝한 rvFMP 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 이 유전자는 1,827개의 nucleotide로 구성된 한 개의 열린 읽기틀(open reading frame, ORF)을 가지고 있으며, 이 ORF는 608개의 아미노산으로 이루어진 분자량, 약 67443.71 Da 크기의 단백질을 암호화할 수 있음을 확인하였다. 또한 이 유전자의 시작 및 종결 코돈은 각각 ATG 및 TAA인 것을 확인하였다. 염기서열로부터 유추한 rvFMP의 아미노산 서열을 다른 비브리오 균주들, 즉 V. fluvialis, Vibrio sp. RC586, V. anguillarum, V. mimicus 및 V. vulnificus 등이 분비하는 5종의 단백질분해효소의 아미노산 서열들과 비교분석한 결과, 평균 80.8%의 서열 유사성이 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 이 효소들은 잘 보존된 단백질분해효소임을 시사하는 것이다. 아미노산 서열의 비교 분석을 통해, rvFMP는 608개의 아미노산으로 이루어진 prepro-rvFMP로 생성되며, 이는 신호서열(24개의 아미노산으로 구성), propeptide 부위(173개의 아미노산으로 구성) 및 Zn2+-binding motif(HEXXHG-X18-E)를 지닌 촉매 영역(411개의 아미노산으로 구성)으로 이루어져 있음을 확인하였다. 본 연구에서는 또한 E. coli에서 발현시킨 rvFMP 단백질분해효소를 2가지 음이온 크로마토그래피(HiTrap Q FF 및 Source 15 Q 4.6/100 PE 컬럼)와 단일 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 75 10/300 GL 겔 여과 컬럼)를 순서대로 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE로 확인한 결과, 정제한 rvFMP의 분자량은 약 44 kDa(rvFMP-44로 명명) 및 39 kDa(rvFMP-39로 명명) 크기를 임을 알 수 있었다. 이 두 효소의 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, rvFMP-44는 N-AEATGTGP-C 서열을, rvFMP-39는 N-SGTTAYSY-C 서열을 N-말단에 지니고 있었다. 이러한 결과는, 전구체효소(zymogen)인 prepro-rvFMP의 N-말단 신호서열과 propeptide 부위가 세포외 분비 과정에서 잘려나가 활성화 효소인 rvFMP-44가 생성되며, 효소의 분리과정에서 N-말단의 51개 아미노산이 추가적으로 rvFMP-44로부터 자가분해(autolysis)에 의해 떨어져 나가 rvFMP-39가 생성됨을 시사하는 것이다. Azocasein을 기질로 확인한 결과, rvFMP 효소활성의 최적 pH와 온도는 각각 7.0 및 50°C임을 확인하였다. 또한 rvFMP의 단백질분해 활성은 1,10-phenanthroline(1,10-PT)와 ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether) tetraacetic acid(EGTA) 등에 의해서는 억제되었으나, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 diisopropyl fluorophosphate(DFP)에 의해서는 억제 되지 않았다. 이러한 결과는 rvFMP가 전형적인 metalloprotease임을 시사하는 것이다. rvFMP는 bovine serum albumin(BSA), fibrinogen, prothrombin, collagen type IV, plasminogen 등과 같은 혈장 단백질들을 분해할 수 있었으며, γ-globulin은 거의 자르지 못하였다. rvFMP는 또한, 시험관 내에서 피브리노겐 및 피브린을 효과적으로 분해함을 확인하였으며, SDS-PAGE를 이용한 절단시험(cleavage assay)과 탁도 시험(turbidity assay)을 통해 분석한 결과, rvFMP는 피브리노겐의 Aα와 Bβ 사슬을 1분 이내에 완전히 절단하고, 피브린 중합체(fibrin polymer)를 효과적으로 분해함을 확인하였다. 또한 rvFMP는 교차-연결 피브린(cross-linked fibrin, XL-fibrin)도 절단할 수 있음을 SDS-PAGE를 통해 확인하였고, plasmin 보다 약 2.5배 더 강한 XL-피브린 절단 활성을 지니고 있음을 피브린 평판시험(fibrin plate assay)을 통해 확인하였다. 본 연구에서는 또한 FeCl3에 노출시켜 혈관 혈전증을 유발시킨 쥐 경동맥과 kappa-carrageenan을 처리하여 혈전증을 유발시킨 쥐꼬리에서 항-혈전증에 대한 rvFMP의 효과를 분석하였다. 대조군으로 phosphate buffered saline(PBS), uPA(5.24 mg/kg), rvFMP(100 µg/kg)를 처리한 경우, 쥐의 경동맥에 혈전이 거의 형성되지 않았으나 FeCl3에 노출시킬 경우, 광범위한 경동맥 혈전증이 유발되었다. 그러나 다양한 농도의 rvFMP(10-100 µg/kg)를 선 처리한 후, FeCl3로 경동맥 혈전증을 유발시킨 경우에는 혈전형성이 농도-의존적으로 감소됨을 확인하였다. 이러한 rvFMP의 항-혈전 활성(anti-thrombotic activity)은 카라기난(carrageenan)-유도 쥐꼬리 혈전증 모델에서도 확인하였다. 카라기난(4 mg/kg)을 처리하여 혈관에 혈전을 형성을 유도한 후, uPA(5.24mg/kg) 또는 다양한 농도의 rvFMP(25-100 µg/kg)를 처리하였을 때, 혈관의 혈전이 농도-의존적으로 감소하였다. 이러한 결과들은 rvFMP가 생체 내에서도 혈관 혈전을 분해할 수 있는 효소활성을 지니고 있음을 시사하는 것이다. 본 연구에서는 또한 rvFMP(1.5 mg/kg)는 생쥐에서 내부 출혈을 유발하지 않으며, 혈장 내 피브리노겐의 농도를 크게 감소시키지 않을 뿐만 아니라 대식세포(Raw 264.7)에서 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 생성도 유도하지 않음을 확인하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 종합할 때 rvFMP가 새로운 직접-작용 혈전 용해제로 개발될 수 있는 가능성을 지닌 후보 효소임을 알 수 있다.