Rif1 methylation by EHMT2 maintains replication fork stability

Abstract

Rif1 메틸화에 따른 복제 포크 안정화 조절 연구 김 민 지 지도교수 : 이 정 희 조선대학교 일반대학원 의과학과 Rif1 은 복제 포크 안정화, DNA 이중가닥 끊김(DSB) 복구 조절, 유전자 발현, 텔로미어 유지 등 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려진 단백질입니다. 이번 연구는 지금까지 알려지지 않았던 Rif1 의 DNA 복제에 대한 다각적인 역할을 새롭게 조명하는 것을 목표로 합니다. 정지된 복제 포크의 뉴클레아제 매개로 한 분해가 유전체 불안정성으로 이어지는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 본 연구는 Rif1 과 EHMT2 와의 상호작용 및 EHMT2 에 의한 Rif1 메틸화를 통해 정지된 복제 포크의 분해를 방지하는 중요한 메커니즘을 밝혀냈습니다. 먼저 Rif1 의 복제 포크 안정화 조절 기전 규명을 위해 Yeast two hybrids 분석을 통해 Rif1 에 결합하는 새로운 단백질 EHMT2 를 동정하였고, Rif1 과 EHMT2 의 상호작용 연구를 통해 유전체 안정성 조절에 있어 Rif1 의 새로운 조절 기전을 확인하였습니다. 또한 이 결과는 DNA 복제 과정에서 Rif1 의 중요한 역할을 이해하는 데 도움이 됩니다. EHMT2 는 단백질의 Lysin 잔기 (K) 에 메틸기를 붙이는 대표적인 메틸화 효소로 Rif1 의 메틸화에도 관여된다는 흥미로운 결과를 얻었습니다. Hydroxyurea (HU)는 DNA 복제를 일시적으로 중단시키는 물질로 HU 처리 조건에서 Rif1 의 메틸화 수준이 증가하였고 이는 복제 포크의 안정성과 상관관계가 있음을 확인하였습니다. 단백질 mass spec 분석 결과 Rif1 의 K1160 위치에서의 메틸화가 일어남을 보았고, 새롭게 생성된 DNA 복제 포크에 메틸화 된 Rif1 단백질이 위치함을 단일 세포 수준에서 관찰하는 SIRF (in situ quantification of proteins interactions at DNA replication forks) 분석 실험을 통해 밝혀냈습니다. 이것은 메틸화 된 Rif1 이 복제 손상으로 인해 멈춰진 복제 포크 초기 DNA 를 보호하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 강조했습니다. 유전체 안정성 유지에 필수적인 복제 포크의 분해를 방지하고, 정지된 복제 포크를 효과적으로 재시작하는데 있어 Rif1 메틸화가 중요함을 밝힌 연구결과입니다. 복제 스트레스 상황에서 Rif1 메틸화를 통해 복제 포크를 효과적으로 재개함으로써 유전체 안정성을 유지한다는 연구입니다. 다시 한번 요약하면, 이 연구는 유전체 안정성 유지에 필수적인 부분인 DNA 복제 포크를 보존하는 데 있어 EHMT2 에 의한 Rif1 K1160 메틸화가 중요하며 나아가 게놈 안정성 유지에 기여하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 메틸화와 관련된 Rif1 의 다양한 조절 시스템에 대한 새로운 관점 및 향후 연구의 잠재적 방향을 제시합니다.|Rif1 methylation by EHMT2 maintains replication fork stability

Rif1 maintains genome integrity by protecting the reversal fork at stalled replication forks, ensuring the protection of nascent DNA from overdegradation in the process. Several mechanisms have been proposed for how Rif1 protects the reversal fork, but it is likely that we do not yet fully understand the process. Our results provide evidence that the replication forkprotective function of Rif1 is regulated by the methyltransferase EHMT2. We found that EHMT2 interacts with Rif1 and induces methylation of Rif1 at Lysine residue 1160 in response to replication stress. The methylation-defective K1160R mutant consistently disrupts replication fork protection, DNA2- mediated fork degradation and replication fork restart, and induces genome instability. This suggests that methylation of Rif1 by EHMT2 protects the reversal fork and maintains genome stability. Our results indicate that EHMT2 is a novel regulator of Rif1, and highlight that EHMT2-mediated methylation of Rif1 is a crucial step in the Rif1-mediated replication fork protection and maintenance of genome stability.