원숭이두창 및 백시니아 바이러스 재조합 단백질의 백시니아 바이러스 중화능 연구

Abstract

Background : Vaccinia virus (VACV) is currently being used for the development of vaccines against other infectious diseases and cancers. VACV vaccines provide protection to humans against the ongoing Mpox, but concerns about side effects necessitate further vaccine development. Both VACV and Monkeypox virus (MPXV) belong to the Orthopoxvirus genus and possess two forms of viral infection: enveloped virion (EV) and mature virion (MV). They are known to involve the attachment, fusion, and penetration into target cells mediated by the L1R and A27L proteins in MV, and the A33R and B5R proteins in EV. The L1R and A27L proteins are known as targets for neutralizing antibodies against MV, and monoclonal antibodies specific to L1R have been reported to inhibit virus infection in the early stages. The B5R protein plays a critical role in EV formation, and antibodies against B5R are known to neutralize EV. As for the A33R protein, it is known to be targeted by antibody-dependent and complement-mediated cytotoxicity. DNA-based vaccines expressing the four proteins, L1R, A27L, A33R, and B5R, have been reported to be more effective than vaccines with individual immunogens, possibly due to the induction of synergistic antibodies that can act at different stages of infection during initial exposure and virus transmission. In this study, we aimed to compare and evaluate the immunogenicity by immunizing mice with recombinant proteins alone and simultaneously immunizing them with the A27L protein from MPXV and the EV proteins (B5R, A33R) from VACV. The goal was to identify the optimal antigen that induces humoral immunity.

Methods : Recombinant proteins expressing MPXV A27L, VACV A33R, B5R, and L1R were expressed and purified. SD rats were injected with VACV cell culture supernatant, while BALB/C mice were injected with the recombinant proteins via intramuscular injection. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Indirect ELISA) was performed using the sera of rats injected with VACV cell culture supernatant to evaluate the antigenicity of the four proteins. The sera of mice injected with recombinant proteins were used to confirm antibody titers and neutralizing antibody titers through VACV indirect immunofluorescence assay (IFA), 50% plaque reduction neutralization test (PRNT50), and indirect ELISA.

Results : The antigenicity of the four purified recombinant proteins was evaluated using indirect ELISA. Among the three VACV proteins (A33R, B5R, and L1R) excluding MPXV A27L, the sera of rats injected with VACV cell culture supernatant showed high antibody titers, indicating good antigenicity. Subsequently, using the sera from mice immunized with the recombinant proteins, the IgG antibody titers were determined through IFA, revealing that co-immunization of MPXV-A27L, a MV protein of MPXV, and VACV B5R EV protein resulted in higher antibody titers compared to the individual immunization groups. Similarly, PRNT results demonstrated that the highest neutralizing antibody titers were observed when MPXV-A27L and VACV-B5R were co-immunized with the AS03 adjuvant. Among the individual immunization groups, the neutralizing antibody titers in the sera of mice immunized with VACV L1R protein were comparable to those of mice co-immunized with MPXV-A27L and VACV B5R. Indirect ELISA using the recombinant proteins as coating antigens confirmed reactivity between each protein and the corresponding antibodies in the mouse sera immunized with the respective proteins. Furthermore, the sera from mice immunized with VACV L1R protein exhibited IgG antibody titers reactive to all four proteins (MPXV-A27L, VACV-A33R, VACV-B5R, and VACV-L1R).

Conclusions : When examining the formation of VACV-specific IFA IgG and ELISA IgG antibodies, it was observed that mouse serum samples immunized with both MPXV-A27L and VACV-B5R showed high levels of IFA IgG and ELISA IgG antibodies. However, there was no significant increase in neutralizing antibody titers against VACV. In future studies, it is expected that research investigating humoral immune responses using combinations of two or three proteins, including VACV-L1R and other recombinant protein candidates such as MPXV-B5R, may lead to the discovery of more effective vaccine candidates. Additionally, further research should be conducted to evaluate the protective efficacy of the vaccines against both VACV and MPXV through challenge experiments.|배경 : 오늘날 백시니아 바이러스(Vaccinia virus, VACV)는 여러 전염병 및 암에 대한 백신 개발을 위해 사용되고 있다. VACV 백신은 현재 유행 중인 엠폭스에 대해 사람을 보호하지만 부작용에 대한 우려가 있어 추가적인 백신 개발이 필요하다. VACV와 원숭이두창 바이러스(Monkeypox virus, MPXV)는 Orthopoxvirus 속으로 enveloped virion (EV)과 mature virion (MV) 두 가지 감염 형태를 가지고 있으며 MV의 L1R과 A27L 단백질, EV의 A33R과 B5R 단백질에 의해 표적 세포로의 부착, 융합 및 침투하는 것으로 알려져 있다. L1R 및 A27L 단백질은 MV 중화 항체의 표적으로 알려져 있으며, 특히 L1R에 특이적인 단클론 항체는 초기 단계에서 바이러스 감염을 억제하는 것으로 보고되었다. B5R 단백질은 EV의 형성에 결정적인 역할을 하며, B5R에 대한 항체는 EV를 중화하는 것으로 알려져 있다. A33R 단백질의 경우 항체 의존성 세포용해와 보체 매개 세포용해의 대상으로 알려져 있다. L1R, A27L, A33R, B5R 네 가지 단백질을 발현하는 DNA 기반 백신은 개별 면역원을 가지고 있는 백신보다 효과적이라는 보고가 있으며, 이는 초기 노출과 바이러스 전파 중에 서로 다른 감염 단계에서 작용할 수 있는 시너지 항체의 유도 때문일 수 있다. 본 연구는 마우스에서 재조합 단백질을 단독 면역화 및 MPXV의 A27L 단백질과 VACV의 EV 단백질 중 B5R과 A33R을 병합 면역화하여 면역원성을 비교 분석 및 평가하였고, 이를 통해 체액성 면역을 유도하는 최적의 항원을 찾는 것을 목표로 하였다. 방법 : MPXV의 A27L 재조합 단백질과 VACV의 A33R, B5R, L1R 재조합 단백질들을 발현 및 정제하였고, SD Rat와 BALB/C mice에 각각 VACV 세포 배양액과 재조합 단백질을 근육 주사하였다. VACV 세포 배양액을 주사한 래트의 항혈청을 이용하여 간접 효소결합 면역흡착 분석법(indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Indirect ELISA)를 수행하였고, 네 가지 단백질의 항원성을 평가하였다. 재조합 단백질을 주사한 마우스의 항혈청을 이용하여 VACV 간접 면역형광법(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)과 50% 플라크 억제 중화 항체 측정법(50% plaque reduction neutralization test, PRNT50) 및 indirect ELISA를 수행하였고, 항체 역가와 중화 항체 역가를 확인하였다.

결과 : 정제한 네 가지 재조합 단백질의 항원성 평가를 위한 indirect ELISA 결과 MPXV의 A27L를 제외한 VACV의 A33R, B5R, L1R 세 가지 단백질에서 VACV 세포 배양액을 주사한 래트의 항혈청이 높은 항체 역가를 보여 항원성이 양호함을 확인하였다. 이후 재조합 단백질을 면역화한 마우스의 항혈청으로 IFA IgG 항체 역가를 확인한 결과, MPXV의 MV 단백질 A27L과 VACV의 EV 단백질 B5R을 병합 면역화했을 때 단독 면역화 그룹보다 항체 역가가 높았다. PRNT 결과도 마찬가지로 MPXV의 A27L과 VACV의 B5R을 AS03 면역증강제와 함께 사용할 때 가장 높은 중화 항체 역가를 확인하였다. 단독 면역화 그룹 중 VACV-L1R로 면역화한 마우스 항혈청에서 중화 항체 역가는 MPXV-A27L과 VACV-B5R을 병합 면역화한 마우스 항혈청의 중화 항체 역가와 비슷한 수준으로 확인되었다. 재조합 단백질을 coating 항원으로 진행한 indirect ELISA 결과, 각 단백질을 면역화한 마우스 그룹의 항혈청에서 해당 단백질과 반응하는 것을 확인하였으며, VACV-L1R 단백질을 면역시킨 마우스 항혈청에서 네 가지 단백질(MPXV-A27L, VACV-A33R, VACV-B5R, VACV-L1R) 모두와 반응하는 IgG 항체 역가를 확인하였다.

결론 : VACV에 특이적인 IFA IgG와 ELISA IgG 항체 형성 및 중화능을 확인하였을 때 MPXV-A27L과 VACV-B5R을 병합 면역화한 마우스의 항혈청에서 IFA IgG 및 ELISA IgG 항체 역가는 높게 확인되었으나, VACV에 대한 중화 항체 역가는 상승하지 않았다. 추후 연구에서는 VACV-L1R 단백질을 포함한 MPXV-B5R 등 다른 재조합 단백질 후보 항원을 이용하여 두 가지 단백질 또는 세 가지 단백질 조합으로 체액성 면역반응을 확인하는 연구가 진행된다면 더욱 효과적인 백신 후보를 찾을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 추가적으로 VACV 및 MPXV에 대한 공격 접종 및 방어 효능 평가에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다.