중증 코로나19 환자의 혈액 응고 병증 규명을 위한 분자기전 연구

Abstract

배경: 코로나19 관련 응고 병증(coagulopathy)은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 감염에서 자주 발생하는 치명적인 합병증으로 환자의 사망률과 관련이 있다. 그러나 이 응고 장애를 일으키는 병인 발병기전은 잘 알려져 있지 않다. 응고 장애와 관련된 분자 메커니즘을 이해하는 것은 코로나19 관련 응고 병증을 완화하는 데 도움이 될 것이다.

방법: 코로나19 환자의 혈액에서 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 후 RNA-sequencing 분석을 통해 유의한 발현 차이를 보이는 유전자들을 확인하였으며, 혈장에서 관련한 protein level을 측정하였다. 62건의 코로나19 검체(경증 환자군 30건, 중증 환자군 32건)와 22건의 대조군 검체(대장균에 의한 패혈증 10건, 건강인 12건)를 대상으로 하였다.

결과: 코로나19 중증 환자군은 경증 환자군에 비해 나이, pneumonia severity index (PSI) 점수, white blood cell (WBC), neutrophil, lymphocyte, D-dimer, aspartate aminotransferase (AST), blood urea nitrogen (BUN), C-reactive protein (CRP) 및 troponin-I에서 유의한 차이를 보였다. 코로나19 사망군은 생존군에 비해 hemoglobin과 platelet에서 유의하게 낮은 수치를 보였다. 코로나19 중증 환자군과 경증 환자군 사이에 1,145개의 차등 발현 유전자(differentially expressed gene, DEG)가 확인되었으며, 유전자의 주요 기능 확인 결과 platelet degranulation, blood coagulation, platelet activation 및 platelet aggregation 등의 응고 병증 관련 유전자이었다. 이런 응고 병증 관련 유전자들이 protein level에서 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 코로나19 중증 환자의 생존군에 비해 사망군에서 tissue factor, thrombomodulin, D-dimer, von Willebrand factor (vWF)의 protein level이 유의하게 증가하였다. 대장균 패혈증군의 경우 protein C는 건강인군과 코로나19 환자군에 비해 protein level이 감소하였다. 대장균 패혈증군에 비해 건강인군과 코로나19 경증 및 중증 환자군에서는 tissue factor pathway inhibitor (TFPI)와 urokinase receptor (uPAR) protein level이 증가하지 않았으며, 경증의 경우 오히려 감소하는 경향을 보였다.

결론: 코로나19 경증 환자군의 경우 F9, F2RL2, SELPG, A2M, SERPINF2 유전자 발현이 감소하였지만, 중증 환자군에서는 이와 더불어 KLKB1 발현이 감소하는 등 kallikrein-kinin system 활성이 억제되었으며, vWF, F2RL3, TBXA2R 등의 발현이 증가하며 platelet activation system이 활성화되었다. 중증 환자군에서는 또한 PLAU, PLAUR 등의 섬유소 용해계(fibrinolysis system)가 활성화되면서, SERPINB2, SERPINE2 유전자 발현이 증가하며 항섬유소 용해계(antifibrionlysis system)도 동시에 활성화됨이 확인되어 중증에서 응고 병증이 진행되는 기전을 확인하였다. 코로나19 환자군의 경우 대장균 패혈증군과 비교하여 tissue factor나 vWF가 유의하게 증가하나 protein S는 유의하게 감소하여, 대장균 패혈증군에 비해 더욱 더 응고 병증이 악화되는 기전을 확인하였다.|INTRODUCTION: Coronavirus disease 2019 (COVID-19)-associated coagulopathy is a fatal complication that occurs frequently in severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection and is related to the mortality of patients. However, the molecular pathogenic mechanisms that cause this clotting disorder are unknown well. Understanding the molecular mechanisms associated with coagulalopathy will help alleviate COVID-19-associated coagulopathy.

METHODS: Transcriptome analysis was performed with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) separated from the blood of patients with COVID-19, and the corresponding protein levels were confirmed by quantitative analysis. 62 cases in the COVID-19 group (30 cases on mild patients, 32 cases on severe patients), 22 cases in control group (10 cases on Escherichia coli-induced sepsis patients, 12 cases on healthy persons) were included in the study.

RESULTS: Age, pneumonia severity index (PSI) score, white blood cell (WBC), neutrophil, lymphocyte, D-dimer, aspartate aminotransferase (AST), blood urea nitrogen (BUN), C-reactive protein (CRP), and troponin-I were significant in severe patients compared to mild patients. In addition, hemoglobin and platelet showed significantly lower levels in the non-survivor group compared to the survivor group. The 1145 genes were differentially expressed between severe cases and mild cases. Coagulopathy-related genes such as platelet degranulation, blood coagulation, platelet activation, and platelet aggregation were significantly up-regulated in severe cases. It was confirmed that these genes are recapitulated at the protein levels. In addition, there was a significant increase in protein levels of tissue factors, thrombomodulin, D-dimer, and von Willebrand factor (vWF) in non-survivor group compared to survivor group. In E. coli sepsis group, protein C decreased compared to the healthy group and the COVID-19 group. Compared to the E. coli sepsis group, tissue factor pathway inhibitor (TFPI) and urokinase receptor (uPAR) did not increase in healthy and mild and severe COVID-19, and showed a tendency to decrease in mild group.

CONCLUSION: In mild group, F9, F2RL2, SELPG, A2M, and SERPINF2 gene expression decreased, but in severe group, kalkrein-kinin system (KLKB1) expression decreased. In addition, platelet activation system (gene expression such as VWF, F2RL3 and TBXA2R increased) was activated. Fibrinolysis system (gene expression such as PLAU, PLAUR) and the antifibrionlysis system (SERPINB2, SERPINE2) was also activated at the same time. In patients with COVID-19, tissue factor or vWF increased significantly compared to E. coli sepsis, but protein S decreased significantly, with which coagulopathy may worsen compared to E. coli sepsis.