PRMT5 regulates Homologous Recombination repair through CtIP methylation

Abstract

DNA includes plenty of genetic information but is damaged every day by endogenous and exogenous sources. However, there are many proteins in the cells for maintaining DNA integrity. DNA damage has several types of DNA damage, pyrimidine dimers, DNA crosslinks, base oxidation, replication stress, base oxidation, sing­strand break (SSB), and double­strand break (DSB). These damages are repaired by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), nucleotide excision repair (NER), non­homologous end joining (NHEJ), and homologous recombination (HR). The worst DNA damage among them is DSB because unrepaired SSBs can lead to DSBs through DNA replication. There are two ways to repair DSBs, they are HR and NHEJ. HR as an error­free repair pathway is mediated by BRCA1 and NHEJ as an error­prone repair pathway is mediated by 53BP1. HR is triggered as activation of ATM, then sequentially recruits RNF8, RNF168, BRCA1, CtIP, Mre11­Rad50­NBS1 (MRN) complex, RPA, and Rad51 to DSBs lesion. In the pathway, DNA end resection is an important step and progressed in the 3 steps, initiation, elongation, and extension. Before the beginning of the DNA end resection, 53BP1 has to reposition from the DSBs, because 53BP1 blocks DNA end resection. At first, after repositioning 53BP1, Mre11 as endonuclease makes a nick on the 5’ strands 300~400 nucleotides away from the DNA end. In the second step, Mre11 as an exonuclease processes the DNA from the nick to the DSBs lesion. Finally, EXO1/BLM/DNA2 extends the length of the 3’ overhang. To process the DNA end resection, CtIP is a critical factor. p­CtIP stimulates Mre11 endonuclease activity (at T847) and the interaction with BRCA1 (at S327). We discovered PRMT5, a new binding partner of CtIP, through yeast­two hybrid (Y2H). PRMT5 catalyzes methylation of the substrate, specifically symmetric dimethylation(SDMA). We performed many experiments for proving that PRMT5 is a new regulator of CtIP. We initially found that CtIP bound on the TIM domain of PRMT5 and PRMT5 bound 801­897a.a legion of CtIP. In addition, we confirmed that PRMT5 catalyzes the symmetric dimethylation (SDMA) of CtIP using PRMT5 inhibitor (EPZ015666) and siRNA targeting mRNA of MEP50 (essential for the enzymatic activity of PRMT5). Moreover, we found 8 putative SDMA sites on CtIP through LC­MS/MS, the cells expressing SDMA­inhibited construct in 8 sites through the mutation arginine to alanine, which reduced both the recruitment of CtIP and the efficiency of HR. Taken together, we suggest that the SDMA of CtIP by PRMT5 is essential for HR.|DNA는 수많은 유전 정보를 포함하고 있지만 매일 내/외인성 요인에 의해서 손상을 받고 있다. 하지만 DNA의 무결성을 유지하기 위한 수많은 단백질들이 세포내에 있다. DNA 손상은 pyrimidine dimers, DNA crosslinks, base oxidation, replication stress, base oxidation, sing­strand break (SSB), and double­strand break (DSB)와 같은 몇 가지 유형이 있다. 이 손상들은 염기 절제 복구, 불일치 복구, 핵산염기 절제 복구, 비상동말단결합, 상동재결합 등에 의해 복구된다. 복구되지 않은 SSB는 DNA 복제를 통해서 DSB가 유도될 수 있기 때문에 DSB가 가장 최악의 DNA 손상이다. DSB를 복구하는 방법에는 상동재결합과 비상동말단결합 두 가지가 있다. 오류가 없는 복구 기전인 상동재결합은 BRCA1이, 오류 발생이 쉬운 복구 기전인 비상동재결합은 53BP1이 각각 중재한다. 상동재결합은 ATM이 활성화되고 나서 순차적으로 RNF8, RNF168, BRCA1, CtIP, Mre11­Rad51­NBS1 (MRN) 복합체가 DSB 병소로 recruit된다. 상동재결합 기전에서 DNA 말단 절제는 중요한 단계이고 개시 (initiation), 신장 (elongation), 확대 (extension) 이 세 가지 단계로 진행된다. DNA 말단 절제가 시작되기 전에 53BP1은 DNA 말단 절제를 막고 있기 때문에 DSB 병소로부터 재 이동되어야 한다. 먼저 53BP1이 재 이동된 후 endonuclease인 Mre11은 DNA 말단으로부터 300­400 nucleotide 떨어진 5’가닥에 nick을 만든다. 두 번째 단계에서는 exonuclease인 Mre11이 이전에 만들었던 nick으로부터 DSB 병소 방향으로 DNA를 절제한다. 마지막으로, EXO1/BLM/DNA2가 3’돌출부의 길이를 확대한다. DNA 말단 절제를 진행하기 위해서 CtIP는 중요한 요소이다. 인산화된 CtIP는 Mre11 endonuclease의 활성(T847)과 BRCA1과의 결합(S327)을 활성화시킨다. 우리는 효모단백질잡종법 (Y2H)를 통해서 PRMT5가 CtIP의 새로운 결합 파트너라는 것을 발견하였다. PRMT5는 기질을 메틸화, 특히 대칭적 디메틸화 (SDMA)를 촉진한다. 우리는 PRMT5가 CtIP의 새로운 조절자라는 것을 증명하기위해 많은 실험을 수행하였다. 우리는 CtIP는 PRMT5의 TIM 도메인에, PRMT5는 CtIP의 801­897a.a 부분에 결합한다는 것을 발견하였다. 추가적으로 우리는 PRMT5가 CtIP가 대칭적 디메틸화 (SDMA)를 촉진한다는 것을 PRMT5 저해제 (EPZ105666)와 MEP50 (PRMT5의 효소활성에 필수)을 목표로 하는 siRNA를 사용하여 확인하였다. 게다가, 우리는 LC­MS/MS를 통해 예상되는 8개의 대칭적 디메틸화 (SDMA) 위치를 확인하였고, 이 모든 위치에서 arginine을 alanine으로 돌연변이화를 진행하여 대칭적 디메틸화 (SDMA)가 억제된 단백질이 발현되는 세포는 CtIP의 recruitment와 상동재결합 효율이 감소한다는 것을 발견하였다. 종합해보면, 우리는 PRMT5에 의한 CtIP의 대칭적 디멜틸화 (SDMA)는 상동재조합 복구기전에 필수라는 것을 제안한다.