Characterization of lactic acid bacteria involved in low-temperature fermentation of kimchi based on their genomic and phenotypic properties

Abstract

김치는 다양한 유산균이 발효에 관여하는 우리나라 전통 식품으로 유용 유산균의 훌륭한 보고로 알려져있다. 이에 김치 유산균에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며 그 중 대부분이 중온성 유산균(mesophilic lactic acid bacteria (LAB))에 관한 연구이다. 김치는 일반적으로 저온(<10℃)에서 발효 및 숙성되는 식품으로 저온에서 잘 생육하는 유산균(psychrotrophic or psychrophilic LAB)이 김치 발효에 중요한 역할을 할 것으로 추측되나 그 연구가 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 발효 온도 및 숙성 기간에 따른 우점종의 특성 규명을 위하여 김치를 크게 (1) 0℃ 미만에서 2∼3개월 발효된 김치, (2) 0∼10℃에서 2∼3개월 발효된 김치, (3) 저온에서 6개월 이상 숙성된 김치(묵은지)로 분류하였다. 각 분류별 김치로부터 우점종을 분리한 후 표현형을 분석하고 complete sequence를 기반으로 유전형을 분석하여 그 특성을 규명하였다. 첫 번째로 0℃ 미만에서 김치 발효 시 김치 내 우점종을 규명하기 위하여 전국에서 갓 담근 김치 45종을 수집 후 -1.5∼0°C에서 2∼3개월간 발효시켜 우점 유산균을 분리한 결과 Weissella koreensis가 45종 모든 김치에서 제 1우점으로 나타났으며 이로부터 총 50종의 Weissella koreensis 균주를 분리하였다. 분리된 W. koreensis 균주들의 기능성 종균 및 프로바이오틱스로서의 활용 가능성을 검증하고자 하였다. 먼저, 오르니틴 생성능 분석에서 높은 오르니틴 생성능을 보인 W. koreensis DB1의 오르니틴 생성 최적화 조건 설정을 진행한 결과, 3% 아르기닌을 첨가한 후 pH 5.0으로 조정된 MRS에서 48시간 배양하였을 때 높은 생육(A600: 5.15)과 더불어 최고의 오르니틴 생산량(15,059 mg/L)을 나타내었다. W. koreensis DB1 균주의 안전성 평가에서 API ZYM kit을 활용한 효소활성 측정, 항생제 내성, 용혈성, 바이오제닉 생성능 조사 결과 유해한 활성을 나타내지 않았다. W. koreensis의 표현형과 유전자형 특성 비교를 수행하였을 때 당대사능 분석에서 표준 균주 W. koreensis KACC11853T과 fructose 대사에서만 차이를 보인 균주 W. koreensis SK를 대표 균주로 선정하여 complete genome sequence를 읽고 그 sequence를 분석하였다. W. koreensis SK균주는 4개의 유전자로 구성된 유전자 클러스터(arcA-arcB-arcD-arcC)와 1개의 아르기닌 조절 유전자(argR)에 의해 암호화된 ADI (arginine deiminase) 회로를 활용하여 아르기닌을 대사하는 것으로 나타났다. 또한 유해한 활성을 나타내는 유전자가 확인되지 않았다. 두 번째로 0∼10℃에서 1∼4개월 동안 발효된 김치로부터 분리된 저온생육능 유산균의 특성을 분석하였다. 선행 연구 결과, 상기 조건에서 Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc inhae, Dellaglioa algida와 같은 저온생육능 유산균이 분리되었다. 그 중 김치에서 빈번하게 검출되는 Leu. gelidum subsp. aenigmaticum의 특성 규명을 위하여 선행 연구로부터 분리된 총 6종의 Leu. gelidum subsp. aenigmaticum 균주의 특성을 분석하였다. 균주 6종의 배양 온도에 따른 생육도 측정 결과 최적 생육온도는 25℃였으며 0℃에서도 생육을 나타냈다. 표현형 및 유전형 특성 규명을 위하여 분석 균주 6종 중 30℃ 이상에서 매우 저조한 생육(A600: 0.256)을 보인 전형적인 psychrotrophic 균주 Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum LS4를 선정하였다. LS4 균주가 김치 발효에서 관능적 특성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 해당 균주를 김치액에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 발효시킨 후 발효 김치액의 관능 평가를 진행한 결과 부드러운 신맛과 향상된 풍미에 의해 균주 미접종 김치액 대비 1.0점 향상되어 4.0점(5점 만점법)으로 높은 기호도를 보였다. 기능성 분석 결과, glucose로 구성된 EPS를 생산하는 것이 확인되어 LS4의 chromosome에서 확인된 dextransucrase gene이 실제로 발현되는 것으로 나타났다. 또한, LS4 균주는 강한 항균활성을 보였으며 배양상징액의 항세균활성은 단백분해효소에 의해 저하되었다. 유전자 분석 결과 2개의 bacteriocin 추정 유전자가 검출되어 LS4 균주의 항균활성은 유기산과 더불어 박테리오신에 의한 활성인 것으로 추측되었다. 안전성 분석 결과, LS4 균주는 유해한 활성을 나타내지 않았다. 마지막으로 저온(10℃ 이하) 숙성 묵은지의 우점 유산균 규명과 더불어 비살균 비종균 사용 환경하에서 묵은지 내 특정 균주의 우점 요인을 규명하였다. 선행 연구 결과, 수집 묵은지 40종 중 총 31종의 묵은지에서 P. inopinatus가 높은 우점률로 검출되어 우점종으로 확인되었다. 본 연구에서는 선행 연구로부터 분리된 균주 중 6개월 이상 숙성된 묵은지에서 1우점종으로 분리된 균주 3종(P. inopinatus BC1, BB2, KT1)의 complete genome sequence를 분석한 후 김치 발효 초기∼말기에 관여한다고 알려진 김치 유산균들의 complete genome sequence와 비교 분석하였다. 그 결과, P. inopinatus에서 세균의 적응면역시스템인 CRISPR-Cas system 관련된 유전자의 숫자(65∼120개)가 다른 김치 유산균(0∼51개)에 비하여 월등히 많이 확인되었다. 분리균주 P. inopinatus 3종의 CRISPR-Cas system은 모두 type Ⅱ-A로 규명되었으며 각 균주에서 61∼116개의 spacer로 구성된 CRISPR array가 확인되어 타 김치유산균의 CRISPR array에서 0∼47개의 spacer가 확인된 것에 비해 월등히 많은 spacer를 보유한 것으로 확인되었다. 2021년 선행 연구 결과에서 보고된 묵은지 분리 균주 P. inopinatus BB2, KT1과 2014년 분리된 김치 유래 균주 P. inopinatus WiKim15는 서로 다른 시기, 다른 장소에 분리된 균주임에도 불구하고 다수의 spacer(88개)를 공유하는 것으로 나타났다. P. inopinatus 3종의 균주가 공유하는 spacer와 일치하는 protospacer를 분석한 결과 phage와 세균 genome 내 prophage에 높은 매치를 보이며 타 김치유산균보다 다양한 organism에 매치되었다. 또한, 긴 CRISPR array 사이에 transposase gene에 의해 삽입되는 것으로 추정되는 leader sequence가 확인되었다. 이에, P. inopinatus는 다양한 외래 유전자에 매치되는 spacer를 포함하는 효율적인 CRISPR-Cas system을 활용하여 장기간 숙성에도 불구하고 phage 감염에 저항하여 가혹해진 김치 환경에서 우점하는 것으로 추정되었다. 본 연구에서는 김치 저온 발효의 핵심 균주로 추정되는 김치 유산균의 특성을 규명하고자 하였다. 표현형 및 유전형 분석 기반 분석을 통한 저온 발효 김치 우점 유산균의 특성을 규명하였다. 0℃ 미만에서 2∼3개월 발효된 김치에서 우점한 균주 W. koreensis는 psychrotrophic 유산균으로 확인되었으며 아르기닌 대사 중 생산되는 NH3에 의한 자가 중화능에 의하여 산성의 김치 환경에서 우점한 것으로 나타났다. 0∼10℃에서 2∼3개월 발효된 김치에서 분리된 유산균 전형적인 psychrotrophic 유산균 Leu. gelidum subsp. aenigmaticum은 저온 처리 시 산 스트레스와 염 스트레스 환경에서도 초기 생균수를 유지하여 높은 저온 안정성을 나타냈다. -2∼10℃에서 6개월 이상 발효된 묵은지 우점 유산균 P. inopinatus는 다양한 phage, prophage, plasmid의 서열과 매치되는 다수의 spacer를 포함하는 효율적인 CRISPR-Cas system을 보유하여 김치 장기 보관 시 phage 감염의 위협에도 불구하고 높은 생균수와 함께 우점하는 것으로 확인되었다. 또한 분리 균주의 기능성 분석 결과, 오르니틴 생성능, EPS 생성능, 항균활성 등이 확인되었다. 본 연구 결과는 저온 발효 김치 우점 유산균과 저온생육능 김치 유산균의 특성 이해를 위한 자료를 제공하고 저온 발효 식품 종균으로서의 활용 가능성을 제시하였다.