Cell selectivity, antimicrobial mechanism and anti-inflammatory activity of proadrenomedullin N-terminal 20 peptide and hybrid antimicrobial peptide

Abstract

PART I 프로아드레노메둘린 N-말단 20 펩티드(PAMP)는 다양한 세포 유형에서 발견되는 조절 펩타이드이다. 그것은 많은 생물학적 활동에 관여하고 항균성 펩타이드(AMP)의 일반적인 특징인 염기성 및 소수성 아미노산이 풍부하다. 본 연구에서는 PAMP와 PAMP의 C-말단 펩타이드인 PAMP(9-20)의 세포선택성과 항균기전을 조사하였다. PAMP와 PAMP(9-20)는 표준 박테리아 균주에 대해 강력한 항균 활성(최소 억제 농도: 4-32 M)을 나타내었지만 최고 측정농도인 256 M에서도 용혈 활성을 나타내지 않았다. PAMP(9-20)는 PAMP에 비해 그람 음성균에 대한 항균 활성이 2~4배 증가하는 것으로 나타났다. 세포질 막 탈분극, 막 모방 리포솜에서 칼세인 염료 누출, SYTOX Green 흡수, 막 투과화 및 유세포 분석 연구는 PAMP 및 PAMP(9-20)의 주요 표적이 미생물 세포막이 아님을 나타냈다. 흥미롭게도, 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 FITC로 표지된 PAMP와 PAMP(9-20)가 buforin-2와 유사한 대장균의 세포질에 들어가는 것을 보여주었고, 젤 지연 분석은 PAMP와 PAMP(9-20)가 박테리아 DNA에 효과적으로 결합한다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 세포내 표적 기전이 PAMP와 PAMP(9-20)의 항균작용을 담당함을 시사하였다. 종합하면, PAMP와 PAMP(9-20)는 새로운 항균제의 개발을 위한 유망한 후보물질로 간주될 수 있다.

PART II 2개의 알려진 항균 펩타이드(AMP)를 혼성화하는 것은 박테리아 세포에 대해 향상된 세포 선택성을 갖는 항균제를 설계하기 위한 간단하고 효과적인 전략이다. 본 연구에서 LfcinB6과 KR-12-a4가 Pro-hinge와 연결된 하이브리드 펩타이드인 Lf-KR을 얻었다. 하이브리드 펩타이드 Lf-KR는 강력한 항균, 항염증 및 항생물막 활성을 가졌다. Lf-KR은 양 적혈구(sheep red blood cells)보다 세균 세포(bacterial cells)에 대해 우수한 세포 선택성(cell selectivity)을 나타내었다. Lf-KR은 시험된 12개의 박테리아 균주에 대해 광범위한 항균 활성(MIC: 4–8 M)을 보여주었고, 생리학적 농도의 염(salt)이 존재할 때 항균 활성을 유지했다. 멤브레인 탈분극 및 염료 누출 분석은 Lf-KR의 향상된 항균 활성이 미생물 멤브레인의 투과 및 탈분극 증가로 인한 것임을 보여주었다. Lf-KR은 LPS로 자극된 마우스 대식세포 RAW264.7 세포에서 전염증성 사이토카인(산화질소 및 종양 괴사 인자-α)의 발현과 생성을 유의하게 억제하였다. 또한 Lf-KR은 미리 형성된 다제내성 녹농균(MDRPA) 생물막에 강력한 박멸 효과를 나타내었다. 아울러 미리 형성된 MDRPA 생물막 구조의 많은 부분이 Lf-KR의 첨가에 의해 교란되었음을 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 확인했다. 종합적으로, 본 연구의 결과는 Lf-KR이 항균, 항염증 및 항생물막 약제로서 후보가 될 수 있음을 시사하였다.|PART I Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP) is a regulatory peptide that is found in various cell types. It is involved in many biological activities and is rich in basic and hydrophobic amino acids, a common feature of antimicrobial peptides (AMPs). In this study, the cell selectivity and antimicrobial mechanism of PAMP and its C-terminal peptide, PAMP (9-20), were investigated. PAMP and PAMP (9-20) displayed potent antimicrobial activity (minimum inhibitory concentration: 4-32 M) against standard bacterial strains, but showed no hemolytic activity even at the highest tested concentration of 256 M. PAMP (9-20) showed 2- to 4-fold increase in antimicrobial activity against gram-negative bacteria compared to PAMP. Cytoplasmic membrane depolarization, leakage of calcein dye from membrane mimic liposomes, SYTOX Green uptake, membrane permeabilization, and flow cytometry studies indicated that the major target of PAMP and PAMP (9-20) is not the microbial cell membrane. Interestingly, laser-scanning confocal microscopy demonstrated that FITC-labeled PAMP and PAMP (9-20) enter the cytoplasm of Escherichia coli similar to buforin-2, and gel retardation assay indicated that PAMP and PAMP (9-20) effectively bind to bacterial DNA. These results suggest that the intracellular target mechanism is responsible for the antimicrobial action of PAMP and PAMP (9-20). Collectively, PAMP and PAMP (9-20) could be considered promising candidates for the development of new antimicrobial agents.

PART II Hybridizing two known antimicrobial peptides (AMPs) is a simple and effective strategy for designing antimicrobial agents with enhanced cell selectivity against bacterial cells. Here, we generated a hybrid peptide Lf-KR in which LfcinB6 and KR-12-a4 were linked with a Pro hinge to obtain a novel AMP with potent antimicrobial, anti-inflammatory, and anti-biofilm activities. Lf-KR exerted superior cell selectivity for bacterial cells over sheep red blood cells. Lf-KR showed broad-spectrum antimicrobial activities (MIC: 4–8 M) against tested 12 bacterial strains and retained its antimicrobial activity in the presence of salts at physiological concentrations. Membrane depolarization and dye leakage assays showed that the enhanced antimicrobial activity of Lf-KR was due to increased permeabilization and depolarization of microbial membranes. Lf-KR significantly inhibited the expression and production of pro-inflammatory cytokines (nitric oxide and tumor necrosis factor‐α) in LPS-stimulated mouse macrophage RAW264.7 cells. In addition, Lf-KR showed a powerful eradication effect on preformed multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRPA) biofilms. We confirmed using confocal laser scanning microscopy that a large portion of the preformed MDRPA biofilm structure was perturbed by the addition of Lf-KR. Collectively, our results suggest that Lf-KR can be an antimicrobial, anti-inflammatory, and anti-biofilm candidate as a pharmaceutical agent.