BANF1 regulates MDC1-mediated DNA damage response

Abstract

DNA 손상반응의 핵심 단백질 중 하나인 MDC1은 DNA가 손상되었을 때 손상인식, 복구 및 세포주기 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이런 MDC1의 조절기전을 밝히고자 MDC1을 bait로 yeast two-hybrid를 실시하였고 그 결과 MDC1과 결합하는 새로운 단백질 BANF1를 동정하였다. BANF1는 고도로 보존된 DNA 결합 단백질로써 유사분열, nuclear assembly, 바이러스 감염, 염색질 및 유전자 조절, DNA 손상반응을 비롯한 여러 경로에 관여하는 것으로 보고되어져 있다. 따라서 본 연구에서는 MDC1과 결합하는 새로운 단백질인 BANF1이 MDC1과 관련된 DNA 손상반응에 있어서 미치는 영향을 알아보고자 한다. 이를 위해 먼저 세포 내에서 과발현된 BANF1과 MDC1이 결합함을 확인하였다. 또한, 특정부위가 결핍된 돌연변이 MDC1 과발현을 통해 MDC1의 PST부위에서 BANF1가 결합함을 확인하였다. 다음으로, BANF1가 결핍된 세포에 여러 DNA 손상자극 (IR, HU, CPT)을 가한 후 세포손상 민감도 및 MDC1 활성을 조사하였다. 먼저, BANF1-MDC1 결합은 방사선 조사에 따른 MDC1 활성에는 아무런 영향이 없음을 clonal survival assay, HR/NHEJ activity, MDC1 손상 foci 관찰을 통해 확인하였다. 두번째로 BANF1-MDC1 결합이 HU처리에 따른 MDC1 활성에 미치는 영향을 clonal survival, MDC1과 RPA 염색을 통해 확인한 결과 BANF1-MDC1 결합은 기존에 알려진 HU에 대한 MDC1의 DNA 손상반응과는 무관함을 알 수 있었다. 마지막으로 BANF1가 결핍된 세포에 CPT를 처리하면, 정상세포에 비해 세포민감도가 증가하며, MDC1 손상 foci 및 세포주기 체크 단백질 Chk1의 활성이 감소됨을 확인하였다. 또한, CPT처리에 의해 BANF1가 DNA 손상부위로 이동함을 관찰하였다. 따라서 본 연구는 BANF1가 CPT손상에 의한 MDC1 활성을 조절하는 새로운 DNA 손상조절 물질임을 밝힌 최초의 보고이다.|MDC1, one of the core proteins in DNA damage response, is known to be involved in damage recognition, recovery, and cell cycle regulation when DNA damage occurs. In this study, we sought to elucidate molecular mechanism of MDC1-related DNA damage response. We identified a novel binding protein of MDC1, BANF1, through yeast two-hybrid screening assay. BANF1 is a highly conserved DNA-binding protein that has been reported to be involved in mitosis, nuclear assembly, viral infection, chromatin and gene regulation, and DNA dam-age response. However, it is not clear the mechanism of DNA damage. In this study, it was determined whether BANF1 regulates MDC1 mediated DNA dam-age response by interaction of MDC1. First, we showed that depletion of BANF1 not influence to MDC1 recruitment, DSB repair including NHEJ/HR, sensitivity in IR treatment. To the next, effect of BANF1 in MDC1-mediated response after Hydroxyurea treatment is investigated. BANF1-depleted cells show no differ-ence in MDC1 and RPA recruitment, sensitivity of HU, compared control cells. Therefore, it is found that BANF1 is independent of MDC1 function in IR and HU treated cellular response. However, we showed that knockdown of BANF1 re-sults in hypersensitivity and decrease the MDC1 damage foci to Camptothecin (CPT). Moreover, BANF1 depleted cells show reduced phosphorylation of Chk1 after CPT treatment, which may contribute to DNA damage checkpoint bypass. We also found that BANF1 is recruited to damage site to CPT treatment until 6 hours and then decreased. Collectively, our findings demonstrate a crucial role for BANF1 in CPT damage-mediated response through interaction of BANF1 and MDC1.