Role of low density lipoprotein receptor-related protein 6 in vascular smooth muscle cells migration

Abstract

죽상동맥경화증은 전 세계적으로 높은 사망률을 유발하는 주요 원인 중 하나로, 심비대증, 심부전, 심근경색 등과 같은 대표적인 심혈관계 질환에 속한다. 심혈관계 질환의 일차적인 원인으로 지목되는 죽상동맥경화증의 초기 진행은 혈관평활근세포의 이동으로부터 시작되는 것으로 잘 알려져 있다. LRP6 (Low-density lipoprotein receptor-associated protein 6)는 LDLR family에 속하며, Wnt ligand에 결합하여 Wnt/β-catenin 신호 전달을 활성화하는 공동 수용체로 알려져 있다. LRP6가 과발현 되면 Tcf-4 (T cell factor 4)의 활성화를 증가시켜서 혈관평활근세포의 증식을 유도한다는 보고가 있으며, 반대의 경우로 LRP6(R611C) 모델에서 LRP6의 활성이 감소될 경우에 PDGF (Platelet-derived growth factor)에 의해 유도된 혈관평활근세포의 증식을 촉진시키거나, 분화를 억제함으로써 경동맥 손상모델의 신생 내막 증식 (neointimal hyperplasia)을 일으킨다는 보고가 있다. 그러나 LRP6 조절에 의한 혈관평활근세포의 이동 억제에 대한 기전 연구는 알려진 바가 없다. 그러므로 본 연구에서는 동맥 경화의 원인이 되는 혈관평활근세포의 이동성에서 LRP6의 과발현 및 저해에 의해 미치는 영향 및 기전을 밝히고자 하였다. 먼저 혈관평활근세포는 쥐의 흉부 대동맥에서 획득하였고, LRP6의 역할 규명을 위해 LRP6 과발현 및 저해 아데노 바이러스를 제작하여 western blot을 통해 농도의존적으로 잘 발현되는 것을 확인한 바, 이후 결정된 농도를 실험에 사용하였다. 2D와 3D 이동성 분석에서 LRP6의 과발현시 혈관평활근세포 이동성에 유의적인 변화가 없었으나, LRP6 저해는 혈관평활근세포의 이동성을 현저히 촉진시키는 것으로 확인되었다. 그러나 BrdU assay를 통한 증식성 에서는 유의적인 변화가 없었다. 이를 바탕으로 LRP6의 발현을 저해한 실험 군에서 세포 이동의 지표인 MMP2, 9, 13의 발현 변화를 western blot, q-PCR analysis를 통해 확인한 결과, MMP2와 13에서 유의적인 증가를 확인하였다. zymography, luciferase assay 분석을 통해 MMP2의 유의적인 증가를 추가로 보여줌으로써 LRP6 저해에 의한 혈관평활근세포 이동 증가 효과가 MMP2에 특이적이라는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포의 이동, 성장, 분화, 생존, 염증반응 등 다양한 생물학적 과정에서 형성되어 세포를 세포 외 기질에 연결시키는 구조적인 역할뿐만 아니라, 신호전달의 시작점으로써 신호 조절 역할을 수행하는 것으로 잘 알려진 FAK (Focal Adhesion Kinase)가 LRP6의 공동 수용체인 Wnt와 관련되어 있다는 논문들을 바탕으로 FAK가 LRP6와도 연관이 있을 것이라 생각하였다. 그래서 본 연구는 FAK가 LRP6의 저해로 증가한 혈관평활근세포의 이동에서 어떠한 역할을 하는지 알아보고자 하였다. FAK의 인산화 부위인 Y397과 Y925를 western blot을 통해 확인한 결과, Y397에서는 유의하게 증가하였고, Y925에서는 대조적으로 감소하는 것을 확인하였다. 더 나아가 Y397의 기능이 억제되는 아데노바이러스 제작 및 FAK inhibitor인 Y15와 focal adhesion kinase-related non-kinase (FRNK)를 사용해 추가적인 연구를 진행하였다. LRP6를 저해시킨 혈관평활근 세포에서 돌연변이 Y397, Y15 및 FRNK를 처리한 바, 2D와 3D 이동성 분석에서 LRP6의 저해에 의해 증가된 혈관평활근세포 이동성이 FAK의 인산화 억제 시 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 immunofluorescence staining, zymography 분석을 시행한 결과에서 세포 이동의 중요한 지표인 MMP2 활성이 유의적으로 감소되는 것을 다시 확인할 수 있었다. 추가적으로 western blot을 통해 Akt가 MMP2의 신호전달 체계임을 확인하였다. 이와 같은 결과들을 통해, 본 연구에서는 LRP6 저해 시 FAK 및 Akt 신호전달을 통한 MMP2, 13의 증가에 따른 혈관평활근세포의 이동성 증가를 확인함으로써, LRP6가 혈관평활근세포의 이동성을 조절할 수 있는 새로운 표적 단백질이 될 수 있는 것으로 생각된다.