Pathophysiological analysis of articular cartilage degeneration through 7α,25-Dihydroxycholesterol-induced oxiapoptophagy

Abstract

콜레스테롤로부터 합성되는 옥시스테롤중의 하나인 25-hydroxycholesterol(25-HC)은 다양한 유형의 세포에서 세포사멸 유도와 관련되어 있으며, 7α,25-dihydroxycholesterol (7α,25-DHC)은 CYP7B1에 의해 합성되는 25-HC의 하위 옥시스테롤이다. 본 연구에서는 연골세포에서 대사 증후군과 관절염 사이의 병태생리학적 이화작용 매개체로서 7α,25-DHC의 자가포식 세포사멸(oxiapoptophagy) 유도에 의한 연골퇴행성을 분석하였다.

본 연구에서 7α,25-DHC의 자가포식 세포사멸 유도에 의한 연골퇴행성 분석을 위해, 흰쥐 연골세포에서 qPCR분석, qRT-PCR 분석, western blot 분석, gelatin zymography 분석, NO 생성 분석, PGE2 생성 분석, MTT 분석, Hematoxylin & Eosin 분석, 세포 Live & Dead 분석, DAPI 분석, FACS 분석, 면역조직화학 분석, caspase-3/7 활성 분석, 흰쥐 관절연골조직에서 조직학적 분석 및 관절염 동물모델 분석 등을 시행하였다.

7α,25-DHC은 흰쥐 연골세포에서 nitrite와 PGE2의 생성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 관절연골 구성물질인 aggrecan과 Col II의 mRNA 발현은 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 7α,25-DHC은 MMP-3, MMP-13, iNOS, COX-2 및 PTGS의 mRNA와 단백질의 발현을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 이러한 결과는 7α,25-DHC에 의한 연골세포의 염증유도를 시사한다. 7α,25-DHC은 연골세포의 사멸을 농도 의존적으로 증가시켰으며. apoptosis 소체형성과 핵 응축 현상 등 apoptosis의 전형적인 특성을 유도하였다. 7α,25-DHC은 연골세포에서 세포사멸 유도인자인 FasL의 발현을 농도 의존적으로 증가시키고 이의 하위 세포사멸 인자인 caspase-8을 활성화시켰으며, 이러한 결과는 7α,25-DHC에 의한 연골세포의 외인성 세포사멸(death receptor-mediated extrinsic apoptosis)을 시사한다. 뿐만 아니라 7α,25-DHC은 세포사멸 인자 tBid 활성을 통해 Bax와 Bad 등의 발현을 증가시키고, 세포사멸 억제인자인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현감소를 통해 cytochrom c의 세포질 분비 및 caspase-9를 활성화시켰으며, 이러한 결과는 7α,25-DHC에 의한 연골세포의 미토콘드리아 의존 내인성 세포사멸(mitochondria-mediated intrinsic apoptosis)을 시사한다. 또한 7α,25-DHC에 의해 활성화된 각각의 외인성 및 내인성 세포사멸 인자인 caspase-8과 caspase-9에 의한 caspase-3과 poly ADP-ribose polymerase(PARP)의 활성을 확인하였다. 특히, 7α,25-DHC은 자가포식 바이오마커인 Beclin-1, LC3-I 및 LC3-II의 발현을 증가시켰다. 체외 기관배양 실험에서 7α,25-DHC은 관절연골조직의 caspase-3 발현을 농도 의존적으로 증가시켰다. 뿐만 아니라 7α,25-DHC은 퇴행성관절염 동물모델의 무릎 관절에서 proteoglycan의 발현을 관절연골 퇴행정도에 따라 감소시켰으며, caspase-3와 beclin-1의 발현은 관절연골 퇴행 의존적으로 증가시켰다.

이러한 연구결과는 7α,25-DHC가 연골세포에서 염증을 유도할 뿐만 아니라, 내인성 및 외인성 세포사멸 경로와 더불어 자가포식 기전을 통해 연골세포 사멸을 유도하여 관절연골 퇴행성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 또한 본 연구의 결과는 옥시스테롤 25-HC의 하위 옥시스테롤인 7α,25-DHC가 관절연골 퇴행성과 밀접하게 관련되어 있으며, 대사성 질환과 관절염 사이의 연관성을 제시할 수 있는 병태생리학적 이화작용 매개체임을 제시한다. | The aim of the present study was to investigate the pathophysiology of articular cartilage degeneration induced by oxiapoptophagy, a type of cell death accompanied by oxysterol-induced apoptosis and autophagy, in chondrocytes and articular cartilages treated with 7α,25-dihydroxycholesterol (7α,25-DHC). Lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation increased cell death and upregulated CYP7B1 expression in primary rat chondrocytes, which indicates that LPS-induced cell death involves the 7α,25-DHC synthesized by upregulated CYP7B1. The present study showed that 7α,25-DHC not only accelerated proteoglycan loss from articular cartilage, but also decreased the mRNA induction of type II collagen and aggrecan, major components of articular cartilage, in chondrocytes. Furthermore, 7α,25-DHC upregulated the expression and activity of cartilage-degrading enzymes, such as matrix metalloproteinase (MMP)-13 and MMP-1, and increased the levels of inflammatory mediators, such as inducible nitric oxide synthase (NO), cyclooxygenase-2 (COX-2), nitric oxide, and prostaglandin E2 (PGE2) in chondrocytes. Moreover, 7α,25-DHC not only increased cytotoxicity in primary rat chondrocytes, but also increased the number of chondrocytes with condensed chromatin in a dose-dependent manner. Moreover, 7α,25-DHC-induced cell death was mediated by extrinsic and intrinsic apoptosis in chondrocytes in a caspase-dependent manner. In addition, biomarkers of autophagy, such as beclin-1 and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, increased in chondrocytes treated with 7α,25-DHC. Finally, the immunoreactivity of CYP7B1, caspase-3, and beclin-1 increased in the articular cartilage that exhibited severe proteoglycan loss due to destabilization of the median meniscus in the knee joints of mice. Taken together, our data indicate that 7α,25-DHC induces progressive articular degeneration via accelerating proteoglycan loss caused by the upregulation of catabolic factors, such as cartilage-degrading enzymes and inflammatory mediators, as well as the oxiapoptophagy of chondrocytes through caspase-dependent extrinsic and intrinsic apoptosis accompanied by autophagy. Furthermore, these data suggest that metabolic syndrome may be a critical risk factor for the induction of osteoarthritis by upregulating pathophysiological oxysterols, including 7α,25-DHC, synthesized through cholesterol oxidation.