Molecular Interactions between Cytotoxic Nitric Oxide and Pst Inorganic Phosphate Transport System of Salmonella Typhimurium

Abstract

인(phosphorus)은 세균이 살아가는데 있어 필수적인 요소이며, 주로 무기인산 (phosphate; Pi)의 형태로 세포 내에서 발견된다. 병원성 세균은 숙주세포 내 다양한 스트레스가 주어진 조건에서 Pi 항상성을 유지하기 위해 Phosphate (Pho) regulon을 갖는다. Pho regulon은 PhoB/PhoR two-component system 및 Pi 특이적인 Pst system을 통해 발현이 조절되고, 이는 세균 내 Pi 수송에 절대적으로 필요하다. Pst system은 pstSCAB-phoU 유전자들로 구성된 pst 오페론이며, 세포 외 Pi 농도 감지에 따라 발현이 조절된다. 세포 외 Pi 농도가 높을 경우 pst 오페론을 포함한 Pho regulon의 발현이 PhoB의 탈인산화에 의해 억제되고, 세포 외 Pi 농도가 낮을 경우 인산화된 PhoB에 의해 Pho regulon 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. 그러나 Pst 시스템의 단백질이 Pi 농도를 감지하기 위한 상호작용 및 PhoU와 PhoB/PhoR 간의 상호작용을 통한 신호전달의 분자적 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 또한 세균의 Pi 항상성 유지는 숙주 면역에 의해 생성되는 항균제 중 하나인 산화질소(nitric oxide; NO) 스트레스로부터 생존하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 장내세균인 Salmonella enterica serovar Typhimurium의 Pi 대사 조절에서 Pst 시스템의 분자적 상호작용 및 Pst 시스템 상호작용에서 NO의 영향에 대해 연구하였다. 전사 및 번역 수준에서 세포 외 Pi 농도가 높은 환경(HiPi MOPS)에서 PstS의 발현은 NO 스트레스의 영향을 받지 않았지만, 반대로 세포 외 Pi 농도가 낮은 환경(LoPi MOPS)에서 높은 수준으로 발현이 되어야 하는 PstS가 NO에 의해 발현이 억제되었다. 그러나 ∆phoU 돌연변이에 NO처리는 PstS의 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 Pst 발현의 NO 조절에 대한 PhoU 의존성을 입증했다. 이에 NO가 PstS 발현을 억제하는데 PhoU와 상호작용하는 단백질이 NO 표적인지 확인하기 위해 PhoU와 PstB 상호작용 및 PhoU와 PhoR의 상호작용을 bacterial two hybrid system을 이용하여 분석하였다. 그 결과, PhoU와 PhoR 사이의 상호작용이 NO에 의해 크게 감소한 반면, NO는 PhoU와 PstB 사이의 상호작용에 거의 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 또한 NO가 존재하지 않는 경우, PhoU의 Cys 잔기를 Ser 잔기 로의 돌연변이는 PhoU-PstB 보다 PhoU-PhoR의 상호작용을 현저하게 감소시켰으며, 이는 PhoU의 Cys 잔기의 thiol group이 NO 표적이 될 수 있음을 나타냈다. 또한 이러한 Cys의 nitrosylation은 PhoB 활성화를 조절하기 위해 PhoR에 대한 낮은 Pi 신호전달을 억제하여 PstB와 더 단단히 결합하기 위해 PhoU의 잠재적인 형태 변화를 유발할 수 있음을 시사하였다. Pst 시스템의 NO 조절 메커니즘 및 NO 스트레스와 관련된 PhoU interactome에 대한 추가적인 연구는 NO를 생성하는 숙주 내 Pi 농도가 낮은 조건에서 세균 생존 메커니즘의 특성을 좀 더 연구할 필요가 있다고 생각된다.|Phosphorus is an essential factor for bacteria life, and is mainly found in cells in the form of inorganic phosphate (Pi). Pathogens have phosphate-response (Pho) regulon to maintain Pi homeostasis in a variety of stress environments, such as inside hosts. Pho regulon is regulated through the PhoB/PhoR two-component signal transduction system and the Pi-specific Pst system, necessary for Pi transport in bacteria. The Pst system is expressed by pst operon composed of pstSCAB-phoU, and its expression is regulated by PhoB/PhoR system sensing the extracellular Pi concentration in a PhoU regulator-dependent manner. It has been known that, when the extracellular Pi concentration is high, expression of Pho regulon including pst operon is inhibited by dephosphorylation of PhoB, and when the extracellular Pi concentration is low, Pho regulon expression is actively induced by phosphorylated PhoB. However, molecular mechanisms by which proteins of Pst system interact for sensing Pi concentration and transduce their signals through interactions between PhoU and PhoB/PhoR are remained less understood. In addition, the maintenance of Pi homeostasis in bacteria plays a key role in survival against nitric oxide (NO) stress, one of the antimicrobial agents produced by host immunity. This study has worked on the molecular interactions of the Pst system in the regulation of the Pi metabolism in Salmonella enterica serovar Typhimurium, a pathogen of the family Enterobacteriaceae, and on the effect of NO in Pst system interactions. When the extracellular Pi concentration was high, Pst expression was not affected by NO stress, but on the contrary, when the extracellular Pi concentration was low, the induced PstS expression, which must be highly expressed under Pi-limiting conditions, was largely suppressed by NO. However, NO treatment did not affect the expression of PstS in ∆phoU mutant, demonstrating the PhoU-dependence for the NO-mediated regulation of Pst expression. In order to find out which proteins interacting with PhoU are NO targets for suppressing PstS expression, the interactions between PhoU and PstB and between PhoU and PhoR were analyzed using a bacterial two hybrid system. Results showed that the interaction between PhoU and PhoR was significantly reduced by NO, while NO affected little to the PhoU-PstB interaction. And in the absence of NO, mutation of Cys residues in PhoU to Ser decreased PhoU-PhoR interaction at much higher rate than PhoU-PstB interactions, suggesting that thiols in these Cys residues in PhoU could be the target of NO. It further suggest that nitrosylation of these Cys may lead to potential conformational changes of PhoU to bind PstB more tightly, inhibiting transduction of low Pi signal to PhoR for regulating PhoB activation. Further studies about the NO-mediated regulation mechanism on the Pst system and about the interactome of PhoU associated with NO stress will shed light on the insight into the bacterial survival mechanism under Pi-limiting conditions in NO-producing animal hosts.