대장암 마우스모델에서 포토론이용 광역동치료에 미치는 구리이온의 영향

Abstract

실험 배경 : 대장암은 대장의 상피세포에서 발생하는 암으로 우리나라 사람에서 발생하는 암중에서 3번째로 발병률이 높다. 대장암의 치료는 수술요법, 방사선 요법, 화학요법 및 면역요법 등으로 시행하고 있으며, 생존율을 높이기 위하여 몇 가지 치료법을 병행하여 시행하는 복합적 치료요법이 시행되고 있다. 대장암 치료 후 생존율의 증가는 크지 않기 때문에 새로운 치료방법의 개발이 계속적으로 시도되고 있다. 광역동 요법은 광민감제와 빛을 이용하는 항암 치료법으로 화학요법이나 방사선요법에 비하여 부작용이 매우 적고, 병기에 관계없이 시행이 가능하며, 치료과정에서 환자에게 스트레스가 매우 적은 비침윤적 요법이기 때문에 암치료분야에서 대안적인 새로운 치료법으로 관심을 받고 있다. 그러나 광역동 요법에 의한 항암효과가 제한적이기 때문에 항암효과를 증가시킬 수 있는 방법의 개발이 필요하다. 실험 목적 : 본 연구는 구리이온이 광역동 치료의 항암효과 증가에 미치는 영향을 알기 위해서 대장암에 대한 광역동 치료 효과에 미치는 구리이온의 영향을 관찰하였다. 실험 방법 : 생쥐 대장암 세포(CT26 cell)를 배양하여 Balb/c 생쥐의 피하에 주사하여 암을 유발시킨 후, 암종의 크기가 300~400mm3 인 것을 생쥐 대장암 모델로 사용하였다. 실험군은 대조군, 구리군, 레이저군 및 구리+레이저군 등 4군으로 나누었다. 레이저군과 구리+레이저군에 포토론(2.5 mg/kg BW)을 복강에 주사하였다. 구리군과 구리+레이저군에는 포토론 주사 30분 후에 구리(2.5 mg/kg BW)를 복강에 주사하였다. 포토론 주사 2시간 경과한 후 레이저 광선(파장 660nm, 조사량 80J/Cm2)을 종량의 표면에 조사하였다. 레이저 조사 24시간 경과 후 종양조직을 절제하여 RNA-seq 검사하고, 지질과산화물량을 측정하였다. TBARS 량은 OxiSelect™ TBARS Assay Kit 이용하여 측정하였다. 레이저 조사 후 시간 경과에 따라서 12일까지 암종의 크기를 측정하고 사진을 촬영하여 관찰하였다.

실험 결과 : 종양 용적은 레이저 조사 후 12일째 대조군 420 % 증가, 레이저군 154% 증가, 구리+레이저군 53% 감소로 나타나서, 레이저군에 비하여 구리+레이저군의 종양용적이 현저히 감소되었다. 레이저 조사 24시간 후 종양조직의 TBARS량은 대조군에 비하여 레이저군에서 190 %가 증가되았고, 구리+레이저군은 레이저군보다 68%가 더 증가되었다. 레이저군과 구리+레이저군에서 레이저 조사 24시간 후 종양조직의 기저측부 원형질막 구성단백질 중 암의 발생이나 성장 및 전이에 관여하는 Atp2b4, Hspa1a, Ddr1, Prom2, Nkd2, Slc38a3, Slc4a1, Slc14a1, St14, Tgfa 및 Cldn4 유전자의 발현량 차이가 나타났다. 레이저군에서 Hspa1a, Nkd2, St14 및 Tgfa 유전자 발현량이 증가되었고, 구리+레이저군에서 Atp2b4, Ddr1, Nkd2, Prom2, Slc4a1, Slc14a1, St14 및 Tgfa 유전자 발현량이 증가되었다. 구리+레이저군은 구리군에 비하여 Cldn4, Ddr1, Prom2, Slc4a1 및 Tgfa 유전자 발현량이 증가되었고, Slc14a1 유전자는 발현이 감소되었다. 레이저군과 구리+레이저군에서 레이저 조사 24시간 후 종양조직의 정단부 원형질막 구성단백질 중 Dsg1a, Dsg2, Patj, Slc6a19, Slc34a2, Slc9a3r1 및 Tnik 유전자의 발현량 차이가 나타났다. Dsg1a, Patj 및 Slc34a2 유전자 발현량이 레이저군에서 증가되었다. 구리+레이저군에서 Dsg1a, Dsg2, Patj, Slc6a19, Slc9a3r1, Slc34a2 및 Tnik 유전자 발현량이 증가되어 레이저군에 비하여 발현이 증가되는 유전자가 더 많고, 증가 비율도 더 높았다. 그랜자임은 비루스에 감염된 세포나 암세포를 사멸시키기 위해서 면역세포에서 분비되는 단백질 분해 효소인데, 구리+레이저군 종양 조직 Gzmc, Gzmd, Gzme, Gzmf 및 Gzmg 유전자 발현이 증가되었다. 이상의 실험결과 암생쥐 모델에서 구리이온을 포토론 이용 광역동 치료에 병용하면 종양의 용적감소가 더 증가하고, 지질과산화물이 증가하며, 암의 발생과 성장 및 전이 관련 세포막 단백질 유전자의 발현이 변화되며, 그랜자임 유전자 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 항암효과 증가와 관련이 있는 것으로 추측된다.

결론 : 광역동 요법에서 구리이온의 항암효과 증강 작용은 세포막 지질과산화물량이 증가되는 것으로 미루어 산화적 세포손상의 증가와 관련이 있을 것으로 추측된다. 광역동 치료로 인하여 반응성 산소종이 발생하였을 때 구리이온이 팬텀반응에 의해서 반응성 산소종을 반응성이 가장 강한 히드록시 라디칼로 전환 시켜 세포손상을 증가시키고, 암조직 주변에서 면역세포의 작용에 의한 세포사멸 작용이 복합적으로 작용하여 암치료에 상승효과를 나타난 것으로 생각된다. 광역동 치료에서 구리이온의 병용으로 인한 암치료 상승효과는 암치료분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있기 때문에 이를 임상적으로 이용하기 위해서는 작용기전과 독성 등에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 추측된다. | Background: Colon cancer is the third highest incidence cancer in Koreans. The treatment methods for colon cancer include surgery, radiation therapy, chemotherapy and immunotherapy. However, because the survival rate of cancer patients is not high, it is necessary to develop new treatment methods. Photodynamic therapy is an anticancer therapy that is performed using photosensitizers and light. Compared to chemotherapy or radiation therapy, this method has very few side effects, can be operated regardless of stage, and is a non-invasive therapy. However, since the anticancer effect by photodynamic therapy is limited, it is necessary to develop a method or agent to enhance the anticancer effect. Objective: The purpose of this study is to observe the effect of copper on the increase of anticancer effect of photodynamic therapy using a colon cancer mouse model. Methods: Colon cancer was induced by subcutaneous injection of cultured mouse colon cancer cells (CT26 cells) in Balb/c mice. A mouse tumor size of 300 to 400 mm3 was used in the experiment as a mouse colon cancer model. The experimental group was divided into 4 groups: a control group, a copper group, a laser group, and a copper+laser group. Photolon (2.5 mg/kg BW) was injected into the abdominal cavity to the laser group and the copper+laser group. In the copper group and the copper+laser group, copper (2.5 mg/kg BW) was injected intraperitoneally 30 minutes after photolon injection. 2 hours after photolon injection, a laser (660nm, 80J/Cm2) was irradiated onto the tumor. After 24 hours of laser irradiation, the experimental animals were sacrificed and RNA-seq and lipid peroxide were measured in the tumor tissue. The TBARS level was measured using the OxiSelect™ TBARS Assay Kit. The size of the tumor was measured and observed up to 12 days after laser irradiation. Results: On the 12th day after laser irradiation, the tumor volume increased by 420% in the control group, 154% in the laser group, and 53% in the copper+laser group. The tumor volume was significantly decreased in the copper+laser group compared to the laser group. After 24 hours of laser irradiation, the level of TBARS in the tumor tissue was increased by 190% in the laser group compared to the control group, and 68% in the copper+laser group than in the laser group. After 24 hours of laser irradiation, changes in the gene expression levels of the basolateral plasma membrane proteins Atp2b4, Hspa1a, Ddr1, Prom2, Nkd2, Slc38a3, Slc4a1, Slc14a1, St14, Tgfa and Cldn4 in the laser group and the copper+laser group were observed. In the laser group, tumor tissue Hspa1a, Nkd2, St14 and Tgfa gene expression levels were increased, and in the copper+laser group, tumor tissue Atp2b4, Ddr1, Nkd2, Prom2, Slc4a1, Slc14a1, St14 and Tgfa gene expression levels were increased. In the copper+laser group, the expression levels of Cldn4, Ddr1, Prom2, Slc4a1 and Tgfa genes in tumor tissue were increased, and the expression of Slc14a1 gene was decreased compared to the copper group. After 24 hours of laser irradiation, the expression levels of the apical plasma membrane Dsg1a, Dsg2, Patj, Slc6a19, Slc34a2, Slc9a3r1 and Tnik genes were changed in the laser group and the copper+laser group. In the laser group, tumor tissue Dsg1a, Patj, and Slc34a2 gene expression levels were increased. In the copper+laser group, tumor tissue Dsg1a, Dsg2, Patj, Slc6a19, Slc9a3r1, Slc34a2 and Tnik gene expression levels were increased, and the increase rate was higher than that of the laser group. The expression levels of granzyme, Gzmc, Gzmd, Gzme, Gzmf and Gzmg genes in the tumor tissue of the copper+laser group were increased compared to that of the laser group. As a result of these experiments, when copper is used in combination with photodynamic therapy in a cancer mouse model, the tumor volume decrease, the lipid peroxide level increases, and the expression of cell membrane protein genes related to cancer induction, growth and metastasis are changed, and granzyme gene expression increased, and these results are thought to be correlated with the increased anticancer effect. Conclusion: The enhanced anticancer effect by the combination of photodynamic therapy and copper is believed to be related to the increase in oxidative cell damage, as the amount of lipid peroxide in the cell membrane is increased. Copper acts on reactive oxygen species to increase the production of highly reactive hydroxy radicals by the Fenton reaction, and granzyme secreted from immune cells is considered to have a combined effect with anticancer effects. The synergistic effect of the combination of anticancer photodynamic therapy and copper is a very impressive effect that can be used for cancer treatment, and further studies are needed to use it clinically.